实验五 等电聚焦测蛋白质等电点.doc

实验五 等电点聚焦测蛋白质等电点Mangogola等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要进展，其实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。IEF的关键是得到一定范围内的稳定pH梯度，即找到合适的两性载体。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧基的同系物和异构物的混合物，其氨基和羧基的比例不同，使pH和pI相异、相近。经过适当电泳时间后，两性电解质将依等电点递增的次序在支持物中从正极到负极彼此相互衔接，形成一平滑稳定的pH梯度。蛋白质靠近正极在低于其pI的环境中带正电荷，向负极移动，反之则向相反方向移动，最终停在其pI处。聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离等电点分子因pH的改变而重新带上正或负电荷，从而又向pI迁移。最后测出蛋白质停留位置的pH即为该蛋白质的pH。一实验过程1.圆柱体凝胶制备用封口膜将玻管D4120mm的一端封口，将玻管套上橡胶塞放置在支架上，加入凝胶至10cm处（注意摇动玻管，震出底部气泡），轻轻铺上一层双蒸水，放置聚合1h。凝胶T=7.5%，C=2.7%，共4mL30%Acr，0.8%Bis1mL10%过硫酸铵0.02mL双蒸水2.68mL载体两性电解质0.15mL样品液（BSA-10mg/mL）0.05mL样品液（肌红蛋白-5mg/mL）0.05mLTEMED0.02mL共作三支管，每管加胶液约1.1mL2.聚焦电泳在电泳下槽注入0.2%硫酸500mL，将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳上槽(注意塞紧所有孔，以防电极液下漏)，加入上槽溶液0.5%乙醇胺约1000mL（注意排除凝胶下表面的气泡，凝胶上下表面都要接触电极液）。接上电源，正极接酸，负极接碱，恒压160V至电流为0，再继续通电20min。3.蛋白质染色及等电点测定用注射器向胶管注水取出胶条，测量胶体总长度及肌红蛋白距酸端（碱端）距离。将其中一胶条放在玻璃板上用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入装有2mL10mM的KCl溶液中，浸泡过夜，次日用pH计测每支管中的pH值。另外两只胶条在三氯乙酸中浸泡，等出现灰色条带时量总长及其距酸端（碱端）距离。二数据记录和处理1.标准曲线绘制初始数据如下表：标号12345678910111213pH值8.769.118.639.178.968.277.636.946.576.125.24.383.89由于存在碱端漂移，舍去前三个数据，将其余数据对凝胶长度作图，得标准曲线如下图：即所得的标准曲线为pH=11.85576-0.60503*d2.计算样品等电点总长/cm1肌红蛋白距碱端距离/cm2BSA距碱端距离/cmd1/cmd2/cm胶条19.45.67.77.744710.6489胶条285.356.98.693811.2125注：d=将胶条1和胶条2数据带入求平均值得：肌红蛋白的等电点pI=6.885；BSA的等电点pI=5.24。三注意事项1.本实验凝胶选用化学聚合方法，而没有采用核黄素，是因为核黄素很难溶于水，经常失效，光照不合适难以聚合。2.灌胶时要快速细致，出现气泡要及时将其弹震出去。3.剥取胶时应将针头紧贴玻璃管壁，边向下延伸边注水，小心剥取。4.剥出的胶条放置在平皿中，要及时吸