工业第六章 高产突变育种具体步骤.doc

一、试述高产突变株诱变选育的一般步骤及每步的目的及注意事项。步骤：1、选择出发菌种。（1） 、对一般出发菌株的要求： a、从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽然产量较低，但对诱变因素 敏感，变异幅度大，正突变高； b、在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在生产过程中经过自然选育的 菌株； c、采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多 的菌株； d、由于有些菌株在发生某一变异后会提高对其他诱变因素的敏感性，故有时 可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株； e、采用一类被称为“增变菌株”的变异菌株，它们对诱变剂的敏感性比原始 菌株大为提高，更适宜作为出发菌株； f、在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考虑至少能累计少量所需产物 或其前体的菌株，而在选择产抗生素的出发菌株时，最好选择已通过几次 诱变并发现每次的效价都有一 定程度提高的菌株作为出发菌株。（2）、选择具备一定生产能力或某种特性的菌株作为出发菌株。（3）、选择纯种作为出发菌株。（4）、选择出发菌株应考虑其稳定性。目的：根据需要选择出发菌种，要尽量符合育种所需要的生物学和代谢的特性。2、对出发菌种进行纯化、培养等操作，获得培养液。（1）、确定诱变出发菌株之后，就要进行纯化。因为微生物容易发生变异和染菌。 诱变育种工作中，一般采用34个出发菌株，在逐代处理后，将产量高、 特性好的菌株留作继续诱变的出发菌株。（2）、通过前培养（同步培养）和密集培养制得出发菌种的培养液。目的：同步培养物在诱变剂处理时，群体中变化一致，而且细胞内应具有丰富的 内源性碱基。3、 单孢子（或单细胞）悬液的制备。（1） 、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。（2） 、菌悬液制备方法如下： a、细菌，最好在诱变处理前进行摇瓶振荡预培养； b、产孢子的菌类进行诱变，处理的材料是孢子，而不是菌丝，因为孢子一般 是单核的（如青霉和黑曲霉），菌丝是多核的。 c、不产孢子的真菌，可直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。有三种方法： 第一，菌丝尖端法。第二，处理单菌落周围尖端菌丝。第三，混合处理法。 此法常用于化学诱变剂。目的：制备单孢子（或单细胞）的悬液，为下一步诱变处理做准备。4、 诱变处理及后培养。（1） 、诱变剂种类的选择。 a、选择诱变剂：诱变剂主要对DNA分子上基因的某一位点发生作用。根据 诱变剂作用机制，再结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂进行诱变。 b、根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂：对遗传稳定的出发菌株最好采 用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂进行复合处理， 使 DNA结构发生严重损伤，造成大的变异，然后再采用一些作用较缓的诱变 剂处理；对遗传性不稳定的出发菌株（它们的遗传背景是复杂的）首先进 行自然分离，划分菌落类型，从中选择效价高的、性能好的一类菌落作为 诱变处继续处理，使DNA结构发生微小突变，从中筛选突变体。并结合 自然分离和环境条件的改变，使有效的菌落类型不断增加，成为正常型菌 落。 c、参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂：诱变之前要考查出发菌株的 诱变系谱，详细分析、总结规律性。为了成功地选育具有某种特性的生产 菌种，就要选择一种最佳的诱变剂。对此，事先需要做预备实验，可采用 生产能力分类法来直接比较其效果。通常做法是：取几种诱变剂，各取不 同剂量做一系列诱变试验，挑选处理后的菌落上千个，进行生产能力的测 定，作出生产能力分布状况。然后分别统计它们的正突变株、负突变株和 稳定株的频率。（2） 、最适诱变剂量的选择。 a、高产菌株在低剂量时效果较好，而对多核细胞、孢子、低产菌株或质量性 状处理剂量不宜过低。 b、经多次诱变处理已钝化的菌株可用一次高剂量处理来激活；一次较高剂量 的强诱变后，通常接着进行23次较低剂量的温和诱变，以利于菌株遗传 性状的稳定。 c、在一次诱变中，可以分别采用不同剂量处理出发菌株，从中选出最佳剂量。 d、诱变剂量的控制方法：化学诱变剂：诱变剂的浓度、处理时间和处理条件； 物理诱变剂：照射距离、照射时间和照射条件。如下图：（3） 、诱变剂的处理方式。 a、单一诱变剂处理。复合处理：两种或两种以上诱变剂同时处理、不同的诱 变剂交替处理、同一诱变剂连续处理以及紫外线与光复活交替处理等。 b、诱变育种中，诱变处理的方式有多种，常用的有下面几种方式：直接处理： 在缓冲液或无菌生理盐水体系中对出发菌株进行诱变处理，然后涂平板分 离突变株；生长过程处理：在摇瓶培养基或固体平板中加入诱变剂，在菌 体生长时进行诱变处理。（4） 、影响突变率的因素。 a、菌种遗传特性不同。 b、菌体细胞壁结构。 c、环境条件的影响：诱变前预培养和诱变后培养；温度、pH、氧气等外界 条件对诱变效应的影响；平皿密度效应。（5） 、对诱变菌进行后培养，将诱变处理过的细胞在营养丰富的培养基中进行 培养，使突变基因稳定、纯合并表达，消除表型延迟。目的：通过对诱变剂和诱变剂用量的控制，育出高产突变株。5、 突变株的分离与筛选。（1）、常规筛选程序：（2） 、简便筛选程序：（3）筛选的类型： a、随机筛选：主要是随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选。 b、平板菌落预筛：大量菌落经过平板预筛，可保留5%10%的初筛菌株（约 200株），再进行摇瓶发酵培养，复证被筛选菌株的重演性，同时从200 株优良 菌株中筛选出更高产量的突变株。如根据形态筛选变株；根据平 板菌落生化反应筛选变株；采用冷敏感菌筛选抗生素变株；浓度梯度法； 应用复印技术快速筛选变株；琼脂块大通量筛选变株。（4） 、摇瓶液体培养、产物活性测定及摇瓶数据的调整和有关菌株特性的观察 及分析。目的：筛选高产突变株。注意事项：1、 安全问题：各种诱变剂几乎都有致癌作用，因此在操作中应时刻注意安全问 题：个人安全和环境安全。（1） 、个人安全：操作时注意防护，不同诱变剂要求不同防护方法，如-射线 辐射防护要求较高，uv要求较低，而化学诱变剂则要求不与 身体有关部位直接接触；（2）、环境安全：所用物品要经解毒处理；液体经解毒或充分稀释才可以排放。2、工作习惯：要养成良好的工作习惯：如仔细观察细微的形态变化、要详实记 录菌株的诱变史和诱变谱系。诱变育种技术要和其他育种手段相 结合。诱变育种由于其筛选的盲目性，突变的不定向性，工作量 十分大，因此要对整个工作进行合理的设计并结合新技术提高其 工作效率。2、 试述营养缺陷型突变株选育一般步骤及每步的目的及注意事项。营养缺陷型突变株：营养缺陷型是一种生化突变株，它的出现是由基因突变引起的。遗传信息的载体是一系列为酶蛋白编码的核酸序列，如果核酸序列中的某碱基发生突变，由该基因所控制的酶合成受阻，该菌株也因此不能合成某种营养因子，使正常代谢失去平衡。 野生型（wild type)：从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，均称该微生物的野生型。原养型（prototroph) ：营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的、其营养要求在表型上与野生型相同的菌株。1、营养缺陷型的诱发。营养缺陷型的诱变方法和所用的诱变因子与普通诱变育种基本相同，只是由于营养缺陷型属于单一基因突变，各种诱变剂的功能不同，有的不宜作为营养缺陷型诱变剂。目的：通过特定的诱变处理，使其中核苷酸中的碱基发生改变，变为通营养缺陷 型突变株。2.、淘汰野生型菌株。原理：限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被 杀死或生长后被除去。 方法：差别杀菌：利用芽孢或孢子比营养细胞更耐热的特点。将诱变处理的 细菌形成芽孢，把芽孢在基本培养液中培养一段时间，然后加热杀死 营养体。由于野生型芽孢能萌发所以被杀死，而营养缺陷型不能萌发 不被杀死。（1） 、抗生素法：常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青霉素 法，后者用制霉菌素法。 原理：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类，而青霉素能抑制细胞壁肽聚 糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的 细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死 处于休止状态的细菌。 （2） 、抗生素淘汰野生型的方法和步骤： a、将诱变处理后的菌体用完全培养液振荡培养23代以 结束表型延迟现 象，达到稳定的表型和生理状况。 b、饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮于无氮基本培养基中培养4-6 小时，耗尽细胞内氮源，防止加抗生素后的“误杀”； c、加抗生素处理：加入等体积的2N基本培养基（两倍浓度氮源的基本培养 基），同时加入抗生素，培养一定时间，野生型细胞由于生长而被杀死， 缺陷型细胞处于休止状态而得以保留。 d、取样分别涂布MM和CM平板，菌落数差异大的浓缩效果较好。 （3） 、菌丝过滤法：适用于丝状真菌。将诱变后的孢子接种至MM中，控制培 养时间，使野生型长成菌丝体，通过过滤而除去菌丝体， 反复几次后，剩余的多为缺陷型孢子。（4） 、饥饿法：该方法用于在某些条件下浓缩双缺突变株。原理：微生物的某 些另一营养缺陷型突变，这一细胞反而会因代谢平衡的恢复而 避免死亡，从而双重缺陷型突变株可被浓缩。目的：通过抗生素法、菌丝过滤法及饥饿法除去其中的野生型菌株。 3、营养缺陷型的检出。（1） 、限量补充法 ：MM+0.01%蛋白胨：野生型菌落大，缺陷型菌落小 ， 限量法。如果要筛选特定的营养缺陷型，可以在MM中 加入少量的这种单一生此为长因子，此为补充法。（2） 、夹层培养法 ：制备琼脂平板并培养，长出菌落后作记号，加第四层培养 基CM 培养，新长出的菌落多为缺陷型。（3） 、逐个检出法：分离得单菌落，CM 点种，逐个菌落依次点种至MM和 CM上培养，在MM上不长、CM上长的菌落为缺陷型。 如下图所示:（4）、影印培养法 ：分离单菌落CM，用“印章”影印至MM 和CM上培养， 在MM上不长所对应的CM上的菌落即为缺陷型，筛选 特定的缺陷型时，用SM取代CM则可以得到目的菌。 如下图所示：目的：除去野生型菌株，检出营养缺陷型菌株。4、营养缺陷型的鉴定。 通过营养缺陷型检出，仅仅了解突变体属于营养缺陷型菌株，只有通过鉴别测定，才能确定菌株属于哪一类营养缺陷型（如氨基酸类、维生素类、核酸类、碳源或氮源类以及无机盐类营养缺陷型等）或更具体的是缺陷哪一种营养因（缺哪种氨基酸或哪种维生素）。（1）、大类的鉴定。用于营养缺陷型测定的氨基酸有21种。用于鉴别缺陷型菌株的维生素约有15种。核酸碱基有7种。方法： 缺陷型菌经CM液体培养后，离心洗涤，制成107-108个/ml菌悬液。取0.1ml涂布至MM平板上，分别用无菌小滤片沾取少许各种营养因子后，放入接种的MM上，适宜温度下培养，（2） 、详细鉴定。生长因子组合：10种生长因子分成4组，15种分成5组，21种分成6组。 将各营养因子等量混合，研细成粉未；或按照规定量制成混合液。若氨基酸为DL型，则用量加倍。 方法：直接加固体粉未或用无菌滤纸片取少许混合液加至培养基平板上培养。判断：生长圈：单缺 ；棱形生长带：双缺或多缺；抑菌圈：生长因子浓