氨基酸的薄层层析.doc

氨基酸的薄层层析1、 实验目的1. 掌握薄层层析法的一般原理。2. 掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。3. 学会根据移动速率（Rf值）鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。2、 实验原理1.层析技术是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等）使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的的一种技术。而吸附层析是利用吸附剂表面对不同物质吸附性能的差异进行物质分离的一种方法。薄层层析法是吸附层析的一种，一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。2.硅胶是吸附薄层中常用的吸附剂之一。层析用硅胶的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基，这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附.硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。另外，硅胶的活化温度通常为105110，不能过高。3.氨基酸与茚三酮的显色反应。茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛，与此同时，还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。4.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率Rf值来表示。层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。3、 材料与方法1. 实验材料1) 样品1 氨基酸标准溶液：0.01mol/L丙氨酸，0.01mol/L精氨酸，0.01mol/L甘氨酸各适量：2 混合氨基酸溶液：将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成适量混合溶液。（上述溶液均已由老师提前准备）2) 试剂1 硅胶G(C.P.) 2 0.5%羧甲基纤维素钠。3 展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） （均已由老师提前准备）3) 仪器及器材层析板（615cm），托盘天平，小烧杯，药匙，量筒（10mL），小尺子，铅笔，毛细玻璃管，层析缸，烘箱。2. 实验步骤1) 实验流程显色处理和结果分析层析点样制板 2) 操作步骤及注意事项步 骤操 作注 意 事 项1制板（1）调浆：用托盘天平称取硅胶3g，加0.5%的羧甲基纤维素钠8ml，调成均匀的糊状。（2）涂布：取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 （3）干燥：将玻璃板水平放置，室温下放置0.5h，自然凉干。 （4）活化：70烘干60分钟。1 玻璃板要清洁平整，无油污。2 粘在玻璃板侧面边上的硅胶粉应去掉，否则在层析时会有较强的边缘效应。2点样（1）标记：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点并做好标记。每个样品间相距1cm。（2）点样：用毛细管分别吸取丙氨酸、精氨酸、甘氨酸及混合氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。加样原点扩散直径不超过2mm。点样后让样品自然风干，必要时重复加样。1 重复点样时必须等第一点样品干后再点第二点。2 点样的次数依照样品溶液的浓度而定，样品量要适当，点样后样品斑点直径一般为0.2cm。3层析将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线。1 样点不能浸入到溶液中。2 将层析缸盖涂上凡士林，防止层析液挥发。4显色用热风吹干或在90下烘干30min，即可显出各层斑点。5.数据处理利用小尺子测量各氨基酸色斑中心到原点中心的距离（a）以及溶液前缘到样品中心的距离（b），计算Rf值，判断混合氨基酸的组分。备注：整个层析过程中，避免用手接触层析板，防止污染层析板，必要时戴上手套。 四结果与讨论1. 结果1) 层析结果溶剂前沿2) 数据记录测定次数各氨基酸色斑中心至原点中心的距离（a）丙氨酸甘氨酸精氨酸混合点1混合点2混合点3123平均a值溶剂前缘至样品原点中心距离（b）3) 结果计算与记录各斑点Rf值氨基酸名称丙氨酸甘氨酸精氨酸混合点1混合点2混合点32. 实验结果分析结合此次实验其他小组的实验现象，我对此次实验实验失败的现象的描述以及可能原因的分析如下表所示现 象解 析（1）斑点显色不明显点样过少（如甘氨酸样点）。（2）斑点展开距离过短层析时，样点部分浸入液面以下，导致部分样品溶解在展开剂中，部分展开在薄层板上。（3）斑点拖尾，不集中硅胶颗粒太小；点样后风干时间过久，使氨基酸分子，牢固地吸牢在薄层板上，在展层过程中，样品点的每个物质分子，不能在层析纸