生化DNA代谢BY R9-303.doc

DNA代谢一、DNA复制 DNA复制受控于一套基本规则1DNA半保留复制： 当细胞分裂 DNA进行复制时，双螺旋结构解开而成为单链，按碱基互补配对原则合成新的互补链。子代细胞中的DNA双链，其中一条单链完全重新合成，另一条单链是亲代链的完整保留。2复制从一个起点开始，通常向两个方向进行。3复制是一个高度协调的过程，母链的解旋和复制同时进行。 细菌DNA环的一端或两端都是活动点，被称作复制叉，那里的亲代DNA解链，两条链同时进行复制。 细菌染色体的复制是双方向的，环的两端都具有活动的复制叉。 复制环总是开始于一个固定的位点，称为起始点。复制开始于起始点并双向同时进行。4DNA合成的5-3方向性及半不连续性 DNA新链的合成沿5-3方向进行，即DNA链只在末端的游离3羟基上增长，模版DNA链是35的。 以复制叉移动方向为准，前导链沿53方向连续合成，后随链也从5-3方向合成，但与复制叉方向相反。 后随链由合成的许多小片段先后连接而成的，该片段称为冈崎片段。 DNA复制过程DNA复制所需的酶：核酸酶，DNA聚合酶，连接酶 核酸酶降解DNA 核酸酶：降解DNA，只专门作用于DNA。主要分为两类：外切核酸酶和内切核酸酶。 外切核酸酶从分子末端降解核酸。许多外切核酸酶只能将双链核酸一条链上的核苷酸从5端或3端切下来。 内切核酸酶可以从核酸链或分子的任意点开始降解。 限制性内切酶只在特定的核苷酸序列处切开。 DNA聚合酶合成DNA 基本的反应是通过增长的DNA链的3末端核苷酸的3-OH对即将引入的5-脱氧核苷三磷酸的5-磷酸进行亲核攻击而实现的，合成方向是5-3，反应中会生成无机焦磷酸盐。 DNA聚合的过程需要有两个必要条件：所有聚合酶都需要模版。DNA聚合反应需要有引物。引物的3末端带有能与核苷酸相结合的游离3羟基，引物通常是寡聚RNA。 大肠杆菌至少含有5种聚合酶 DNA聚合酶I DNA聚合酶II：与DNA修复有关 DNA聚合酶III：复制过程中最重要的酶 DNA聚合酶IV和DNA聚合酶 V：与一种不常见的DNA修复方式有关 DNA聚合酶I 在复制中不是最主要的酶，而是通过它的53外切酶活性在复制、重组以及修复过程中起清除作用。 Klenow片段是将53外切酶结构域取出后的片段，保留了合成与校对功能。 完整的DNA聚合酶I上的53外切酶可通过切口平移过程替换与模板链配对的一段DNA或RNA。 酶的这些活性对复制过程中的DNA修复和RNA引物的去除均有作用。 DNA复制酶系统（DNA的复制过程需要的酶和蛋白质因子）1 解旋酶：使母链解开螺旋；2 拓扑异构酶：减弱螺旋状DNA结构解旋后的拓扑应力；3 DNA结合蛋白：稳定DNA单链；4 引物酶：促使与模版结合的引物RNA片段的合成；5 DNA聚合酶；6 DNA连接酶：RNA引物被切除，并被DNA替代后，将DNA骨架上的断口接上并形成两条连续的新链。 DNA分子合成可分为三步：合成起始 大肠杆菌复制起点oriC，包含一个由13个碱基对组成的3次重复片段和一个由9个碱基组成的4次重复片段。 合成起始的关键部分是DnaA蛋白：20个DnaA蛋白质分子结合到9个碱基对组成的4次重复片段，再识别由13个碱基对组成的3次重复区域（富含A=T），并使此处DNA相继发生变性。在DnaC蛋白的协助下，DnaB蛋白的两个六聚体分别附在DNA两条链上，从两个方向对DNA进行解旋并形成2个潜在的复制叉。 起始阶段是DNA复制中唯一一个可以受调节的阶段，由于受到调节而使得在一个细胞周期中只发生一次复制。 Dam甲基化酶可以使oriC DNA甲基化，DNA的甲基化以及与细菌质膜的相互作用可以影响复制的起始时间。DNA片段的合成及延伸 母代DNA被DnaB解旋酶解旋，前导链的合成前导链的合成较直接，由DnaG引物酶在复制起点处合成一个短链RNA引物。脱氧核苷酸由DNA聚合酶III加到引物上，合成与复制叉处DNA解旋同步。后随链的合成后随链的合成是以冈崎片段的形式进行。首先DnaB解旋酶和DnaG引物酶合成一个RNA引物，DNA聚合酶III与RNA引物结合，催化加上脱氧核苷酸。DNA聚合酶III离开与新的引物结合， RNA引物被DNA聚合酶I的53外切酶活性除去，并通过同样的酶催化合成DNA取而代之，留下的切口由DNA连接酶封闭。 前导链和后随链合成之间的协调两条链都是由一个不对称的DNA聚合酶III二聚体合成。这要通过将后随链所在的DNA弯曲，使两个发生聚合反应的位点靠拢在一起才得以实现的。合成终止 Ter序列结Tus蛋白质，Tus-Ter复合体能抑制单方向前进的复制叉，该复合体只能对一个复制叉起作用。 一个复制叉遇到Tus-Ter复合体时，复制停止；另一个复制叉遇到已停止的复制叉后也停止复制。 DNA复制过程非常精确，依赖于：碱基互补配对：错误的核苷酸可以与模版的碱基形成氢键，但通常无法进入酶的活性中心。校对：聚合酶加上了错的核苷酸则无法继续，35外切酶的活性除去不匹配的核苷酸之后，聚合酶重新工作。错配修复。 真核生物的复制 真核生物的DNA复制的重要性质与原核生物相同。 所有真核生物DNA复制的起始都需要一个多亚基的蛋白质，即起点识别复合体（ORC）。 真核细胞中有多个复制起始点，多点复制可能是真核生物的独特性质。 DNA聚合酶不具备校正35外切核酸梅的活性，仅能合成后随链上冈崎片段的短引物。 DNA聚合酶具有35外切核酸酶的校对功能，在复合物中与细菌的DNA聚会酶III相似。二、DNA修复 突变 突变：DNA核苷酸序列的永久性改变（替代突变，插入或缺失突变）；多数突变是有害的。 沉默突变：对DNA没有本质影响，或对一个基因功能的影响可以忽略不计的突变。 在哺乳动物中，突变的积累与癌症之间有密切关系。 所有细胞都有多重的DNA修复系统 修复系统的数量和多样性既反映DNA修复对细胞存活的重要性，又反映了DNA损伤的多样性。 DNA修复是可能的，因为DNA分子由两条互补链构成，DNA损伤在一条链中可被切除，并没有损伤的互补链作为模版复制新链而得以准确修复。 错配修复 细胞是通过甲基标记的DNA模板去区别旧链和新合成的链。 链的识别是基于Dam甲基化酶的作用，即DNA的甲基化总是在(5)GATC序列在腺嘌呤N6位上。 在新合成的链中，瞬间未被甲基化的GATC序列与模版可以区分开来，再依据已甲基化的模版的信息去修复。 间隔较远的GATC序列引导的错配修复，则由MutL蛋白和MutS（识别错配）蛋白形成复合物，再结合所有的错配碱基对，遇到MutH蛋白（识别(5)GATC）后，MutH蛋白在GTAC序列靠5端的G处切断非甲基化链。 错配在切点5端，非甲基化链沿着35方向从切点向错配点降解，需要DNA解旋酶II、SSB和外切核酸酶或以及DNA聚合酶III、DNA连接酶； 错配在切点3端，非甲基化链沿着53方向从切点向错配点降解，需要DNA解旋酶II、SSB外切核酸酶或RecJ核酸酶以及DNA聚合酶III、DNA连接酶。 碱基切除修复 所有细胞都有一类DNA糖基化酶，能够识别一些特别普通的DNA损伤，并通过断裂N糖苷键来切除受影响的碱基。这种切除会在DNA产生脱嘌呤或脱嘧啶位点，一般称为脱碱基位点或AP位点。 AP位点是由DNA中的N糖苷键的慢速自发水解产生的。 AP位点形成后，损伤的脱氧核糖5-磷酸被AP内切核酸酶切除，切除的DNA片段由DNA聚合酶催化合成的新链取代，留下的DNA缺口由DNA连接酶连接。 核苷酸切除修复 DNA损伤会造成DNA螺旋状结构的扭曲，它可以通过核苷酸切除来修复。 在大肠杆菌中，关键的酶复合物是ABC核苷酸切除酶，它可以在DNA上产生两个切割点。 在核苷酸切除修复中，核苷酸切除酶在损伤庞大的损伤部位与DNA结合，多亚基酶水解损伤中的任意一侧DNA链的磷酸二酯键，DNA片段在解旋酶帮助下去除，缺口在大肠杆菌中由DNA聚合酶填补，在人体内由DNA聚合酶填补，切口由DNA连接酶封闭。 直接修复 最典型的例子是环丁嘧啶二聚体的直接光反应，该反应由DNA光解酶引发。 嘧啶二聚体由光诱导反应产生，光解酶利用吸收的光能使损伤修复。 当双链断裂、双链交联或损伤发生在单链DNA时，互补链自身损伤或缺失：重组DNA修复：同源遗传的重组需要的信息来自独立、同源的染色体；易错修复/SOS应答：DNA损伤高频发生时细胞对大规模DNA损伤所产生的应激反应；SOS蛋白产生特异性的DNA聚合酶，可以跳过那些阻碍复制的损伤基因来进行复制。三、DNA重组 遗传重组可分为三种类型：同源遗传重组、位点特异性重组、DNA转座 同源遗传重组 涉及到具有几乎相同序列的延伸区域的任意两个DNA分子之间或者同一个分子的片段之间的遗传交换。 在细菌中，同源遗传重组通常用于对DNA损伤部位受阻的复制叉的重建，也出现在细胞接合作用等过程。 在真核细胞中，同源遗传重组一般与细胞分裂及DNA修复相关，重组高频发生于减数分裂过程。 通过同源遗传重组，遗传信息在紧密结合的染色单体间进行交换，同源基因重组包括DNA的分离和重组。 同源遗传重组具有多种功能它可以修复几种类型的DNA损伤在真核细胞中第一次细胞减数分裂过程中，同源重组为促进染色体的有序分离提供了一个暂时的物理连接。他增加了遗传群体的遗传多样性。 位点特异性重组 重组只限于特定的DNA序列中。 每一特定位点的重组系统涉及到一种称为重组酶的酶和一段短的（20200个碱基）而且独特的DNA序列，在此处重组酶起作用。 位点特异性重组的结果取决于重组位点在双链DNA分子中的位置和方向。 DNA转座 它通常含有一个短的可以从染色体的一处移到另一处的