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液相色谱基础 2 色谱起源 俄国植物学家茨维特 Tswett 在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的 色谱法 Chromatography 因之得名 3 岛津高效液相色谱仪LC 10Avp系列 4 高效液相色谱分析过程 高效液相色谱仪由高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 记录系统等五大部分组成 分析前 选择适当的色谱柱和流动相 开泵 冲洗柱子 待柱子达到平衡而且基线平直后 用微量注射器把样品注入进样口 流动相把试样带入色谱柱进行分离 分离后的组分依次流入检测器的流通池 最后和洗脱液一起排入流出物收集器 当有样品组分流过流通池时 检测器把组分浓度转变成电信号 经过放大 用记录器记录下来就得到色谱图 色谱图是定性 定量和评价柱效高低的依据 5 色谱分离过程 6 高效液相色谱原理 色谱法 利用样品组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术流动相 携带样品流过整个系统的液体固定相 静止不动的一相 化学键合型固定相 7 高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法法 HighperformanceLiquidChromatography HPLC 与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀 小颗粒具有高柱效 但会引起高阻力 需用高压输送流动相 故又称高压液相色谱法 HighPressureLiquidChromatography HPLC HPLC有以下特点 高压 压力可达15 30MPa 高速 流速为0 001 10 000ml min 高效 在一根柱中同时分离成份可达100种 高灵敏度 紫外检测器灵敏度可达0 01ng 荧光和电化学检测器可达0 1pg 8 高效液相色谱法的分类 按分离机制不同分为液固色谱法键合相液相色谱法正相色谱法反相色谱法离子交换色谱法离子对色谱法体积排阻色谱法 9 液相维护流程图 色谱柱 10 流动相 流动相选择注意事项 纯度 采用 HPLC 级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配 11 溶剂前处理 过滤 0 45um或更小孔径滤膜目的 除去溶剂中的微小颗粒 避免堵塞色谱柱 尤其是使用无机盐配制的缓冲液 脱气目的 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响 1 柱流量不准2 检测器基线波动脱气注意点 1 每天脱气 无在线脱气器时 2 混合溶剂脱气时间不能过长 12 工作原理 在线脱气机 13 何时需要使用在线脱气机 14 输液泵 送液方式 恒流控制恒压控制VP系列 LC 10ADvp泵和LC 10ATvp泵Prominence LC 20AD LC 20AT LC 20AB泵D泵 并联微体积往复式泵T泵 串联式往复泵B泵 并联微体积往复式泵 2组 15 等度洗脱和梯度洗脱 等度洗脱 梯度洗脱 16 梯度洗脱 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例 从而使流动相的强度 极性 pH值或离子强度相应地变化 达到提高分离效果 缩短分析时间的目的 优点 可提高分离度 缩短分析时间 降低最小检测量和提高分离精度注意事项 溶剂的纯度要高 否则梯度洗脱的重现性差 17 高压梯度泵系统 18 四元低压梯度泵系统 19 进样器 自动进样器SIL 10HTSIL 10ASIL 20A C手动进样器Rheodyne7725 7725i原理 六通阀 注入方式 1 全量注入2 部分注入 20 手动进样器使用须知 全量进样 进样体积至少为定量环的3倍以上 半量进样 进样量应不大于定量环体积的50 一定要使用合规格的进样器 规格为外径0 028英寸 长2英寸的平头针 一定不能使用尖针 它会严重刮坏转子垫圈 21 装填状态 样品注入 六通阀 22 柱温箱 柱温控制的优点 分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性 23 低价格 小体积可安装手动进样器温度范围室温 15 C 80 C室温传感器保证分析在可靠的温度范围内进行可单独进行操作 容量大 可容纳2个切换阀 手动进样器混合室 VP副控制器CDD L ECD检测池温度范围室温 10 C 80 C Avp 室温 10 C 80 C ACvp 室温传感器保证分析在可靠的温度范围内进行可单独进行操作 CTO 10ASvp 半导体模块加热式 CTO 10A C vp 空气循环式 CTO 10A系列 24 色谱柱 反相色谱柱 C18 C8 氰基 氨基 苯基 正相色谱柱 硅胶 氰基 氨基 离子交换色谱柱 SCX SAX 凝胶色谱柱 凝胶 手性色谱柱 牛血清蛋白 AGP 环糊精等 25 检测器 SPD 10Avp 190 600nm 紫外检测器SPD 10AVvp 190 900nm 紫外检测器SPD M10Avp 190 800nm 二极管阵列检测器RF 10AXL荧光检测器RID 10A示差折光检测器CDD 10Avp电导检测器L ECD 6A电化学检测器ELSD蒸发光散射检测器 26 紫外可见光检测器 Ein Eout A eCl log Eout Ein 比尔定律 检测池 C 浓度 l 优点 1 灵敏度高2 对温度和流速不敏感3 可用于梯度洗脱缺点 仅适用于测定有紫外吸收的物质 原理 27 岛津VP系列紫外检测器功能 设定时间程序 切换检测波长等 双波长检测比例色谱 初步判断峰的纯度停泵扫描 确定组分最大吸收波长 28 时间程序 29 双波长检测 水溶维生素的双波长检测 30 比例色谱 31 停机扫描 32 二极管阵列检测器 色谱图 光谱图 吸光度 波长 时间 33 荧光检测器 优点 1 灵敏度极高 是最灵敏的检测器之一2 选择性好3 对温度和流速不敏感 可用于梯度洗脱缺点 仅适用于测定可产生荧光的物质可检测物质 多环芳烃 霉菌毒素 酪氨酸 色氨酸 卟啉 儿茶酚氨等 具有对称共轭体系 34 示差折光检测器 原理 连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度 优点 通用型检测器缺点 1 对温度变化敏感2 对溶剂组成变化敏感 不能用于梯度检测3 属于中等灵敏度的检测器 35 电导检测器 原理 根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量 优点 对流动相流速和压力的改变不敏感 可用于梯度洗脱缺点 对温度变化敏感 每升高1度 电导率增加2 2 5 广泛应用于离子色谱 主要用于检测水溶性无机和有机离子 36 电化学检测器 原理 测量电活性分子在工作电极表面氧化或还原反应时所产生电流变化的检测优点 1 灵敏度高2 选择性好 只检测电活性物质缺点 1 不适用于梯度洗脱2 对温度 压力变化敏感 37 蒸发光散射检测器 原理 柱流出物雾化流动相蒸发溶质粒子散射光强度检测 优点 1 适用于没有特征紫外吸收或紫外吸收很弱的待测物2 可以应用有强紫外吸收的试剂 如氯仿 丙酮等3 适用于梯度洗脱4 通用型检测器 只要待测物挥发性低于溶剂 即可适用5 对环境影响不灵敏 室温下即可操作6 没有溶剂前缘峰 适用于保留时间短的物质的检测缺点 1 如果流动相不能挥发 如含有钠盐 钾盐等 不适用2