几种基因差异表达分析方法的比较.pdf

北京医学2 0 0 6年第2 8卷第4期 高等生物大约含有1 0 00 0 0个不同的基因 其 中仅有约1 5 得到表达 基因表达的变化是调控细 胞生命活动过程的核心机制 1 因此 分析基因表达 的差异不仅在发育 分化和突变等研究领域有着极 大的应用价值 而且已成为基因克隆的有效手段之 一 其技术发展也非常迅速 目前主要有差减杂交 s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n S H m R N A差异显示逆转 录P C R m R N Ad i f f e r e n t i a l d i s p l a yr e v e r s et r a n s c r i p t i o nP C R D D R T P C R c D N A代表性差异分析 c D N Ar e p r e s e n t a t i o n a l d i f f e r e n c ea n a l y s i s c D N A R D A 和抑制消减杂交 s u p p r e s s i o ns b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n S S H 等 尽管这些具有代表性的方法均 不完善 不能通过它们得到所有的差异表达基因 但 已经有大量的重要基因通过这些方法得到了分离和 鉴定 本文就这些技术的主要原理 基本过程 优越 性和主要缺陷做一比较分析 一 差减杂交 S H是用两种遗传背景相同或大致相同而功能 不同的材料 分别提取m R N A或反转录成c D N A 在 一定的条件下进行杂交 选择性地去除两部分共同 基因杂交形成的复合物 将含有目的基因的未杂交 部分收集后装入载体形成文库 目前差减杂交方法 有以下几种 1 羟磷灰石柱层析法 H A P 2 其原理是实验 样品m R N A反转录成c D N A后 与过量的驱动方 m R N A杂交 将杂交混合物过羟磷灰石柱 杂交部分 c D N A m R N A被吸附 而含有目的基因未杂交的 c D N A被洗脱收集 该方法相对简单 但在实际应用中存在一些问 题 需要大量样品m R N A 有些实验很难达到这 一要求 层析过程较高的温度会使m R N A降解 H A P本身结构复杂 操作过程会稀释杂交后的样 品 所以现在很少应用 2 生物素标记 链亲和蛋白结合排除法 S i v e和 J o h n 3 用生物素标记驱动方m R N A或c D N A 实验方 m R N A反转录成单链或双链c D N A后与驱动方杂 交 混合物中加入一定量的链亲和素蛋白 链亲和素 几种基因差异表达分析方法的比较 佟胜全 与生物素结合形成链亲核素 生物素 c D N A m R N A 复合物 用1 1的酚 氯仿抽提该复合物 未杂交的 含有目的基因的上清被收集 为提高标记效率 现在 一般采用光激活生物素代替d U T P 生物素标记核 酸 原理是在强光照射下 光敏生物素中的N 3释放 出N 2气 生成反应活性极高的氮烯 它易与核酸中 的伯胺基团结合而形成共价标记 这样标记效率大 大提高 该方法目前仍在广泛使用 是构建差减文库的 基本方法 虽然该方法在杂交效率方面有了较大的 提高 但仍存在一些不足之处 要求驱动方核酸 量仍很大 杂交过程中高浓度的线性核酸分子易 形成网络 降低杂交效率 利用酚氯仿抽提杂交 混合物会使目标基因损失较多 3 磁珠介导的差减法 4 其原理是将 d T 2 5固 定在涂有链亲和蛋白的磁珠上 首先用其与驱动方 总R N A在一定条件下混合杂交 以捕获其中的 m R N A 以 d T 2 5为引物 以捕获的m R N A为模板 新合成链的5 端被吸附在磁珠上 用这一带磁珠的 驱动方单链c D N A与实验方m R N A混合 凡是与驱 动方同源的序列可杂交形成磁珠 c D N A m R N A复 合物 用磁架收集混合物 经过几轮差减后 实验方 剩下的m R N A就是异常表达的目的基因 将其反转 录成双链c D N A后装入载体 就可以构建差减文库 该方法的优点是 操作简单快捷 可避免以 前用生物素标记的繁琐过程 在一定条件下将捕 获的m R N A去除后得到的磁珠 c D N A 可反复使 用 相对于非P C R的方法而言 材料用量少 产 物收集相对高 一般驱动方是实验方的5倍 构 成的文库是全长c D N A文库 含有完整的基因 筛选 到有价值的基因可直接用于转基因研究 该方法的 缺点是 虽然通过减少驱动方D N A含量可降低杂交 时形成网络的程度 但同样会遇到全长c D N A杂交 效率不高的问题 尽管如此 该方法仍是构建全长 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院风湿免疫科 邮编1 0 0 7 3 0 综述 2 3 9 北京医学2 0 0 6年第2 8卷第4期 c D N A用得较广泛的方法 目前有试剂盒出售 如 D y n a b e a d s R 研究报道 该方法有许多改进 如将实 验方m R N A反转录成c D N A以增加其稳定性 杂交 后实验方c D N A两端加上接头进行P C R扩增后装 入载体等 二 m R N A差异显示技术 D D R T P C R技术是由L i a n g和P a r d e e 1 于 1 9 9 2 年建立的 其基本原理是利用真核细胞m R N A均含 p o l y A 末端 以及p o l y A 上游2个碱基只有1 2种 组 合 即A T A C A G T T T C T G C T C C C G G T G C G G 的特点 设计3 引物T 1 1 1 2 M N M N为A G C T中的任一种 但M不能为T 分别与总 m R N A进行反转录 从而获得1 2份c D N A 再以 c D N A为模板 以上述T 1 1 1 2 M N为下游引物 以另 一随机寡核苷酸引物 如1 0m e r随机引物为上游引 物进行P C R扩增 理论上 5 端引物随机结合在 c D N A上 且每一条c D N A均有扩增机会 获得大小 不同的扩增片段 扩增时掺入同位素标记的单核苷 酸 扩增结束后进行放射自显影 如果模板c D N A 存在差异 即可显示差异表达的D N A片段 最后可 通过回收目的c D N A 经杂交 克隆和测序进行鉴 定 该方法原理简单 技术成熟 灵敏度高 可同时 比较两种以上不同来源的m R N A样品间基因表达 的差异 但假阳性率高 最高达7 0 三 c D N A示差分析 c D N A R D A是1 9 9 4年由H u b a n k和S c h a t z 5 于 L i s i t s y n和Wi g l e r 6 建立的基因组 D N A示差分析技 术 r e p r e s e n t a t i o n a l d i f f e r e n c ea n a l y s i s R D A 为基础 改进而来 其原理是基因消减杂交与P C R技术结 合 从两个基因组之间筛选差异序列 在这个技术上 加以改进 并应用于m R N A的差异分析 即为 c D N A R D A 双链c D N A用识别4个碱基的限制性 内切酶进行消化后 数学上将产生平均大小为 2 5 6 b p的D N A片段 因此细胞中绝大多数表达的基 因至少有两个酶切位点 对照组和实验组的双链 c D N A经酶切后 两端连接上特定的接头 用相应的 引物进行P C R扩增 得到具有代表性的产物 扩增 子 分别称为对照组 D 和实验组 T 虽然经过酶切 和扩增 产物仍可代表原来c D N A样本的全部信息 扩增后将T和D再分别酶切 连接不同的连接头 进行消减杂交 两组中均存在的相同序列将形成异 源杂交体 T D 差异序列形成同源杂交体 T T或 D D 用T D 特异的引物进行P C R扩增 并去掉来 源于T D的线性扩增产物 将得到存在于T D 中差 异表达的基因片段 对差异产物进行2 3轮的P C R 富集 可清晰地呈现在普通琼脂糖凝胶上 c D N A R D A的优点 高效性 由于进行了 P C R富集 与传统的消减技术相比 更加敏感 可以 筛选出低拷贝的差异基因 操作上也更加简便易行 可靠性 结果重复性好 假阳性率非常低 c D N A R D A也存在一定的局限性 得到的差异片段是 平均为3 0 0 6 0 0 b p的小片段 要获得全长c D N A必 须进行c D N A文库的筛选 在极低拷贝差异基因 的筛选上虽然已进行了改进 7 但仍然有部分极低 拷贝的基因漏掉 四 差减抑制杂交方法 S S H是以抑制P C R s u p p r e s s i o nP C R 8 为基础 由C L O N T E C H公司 加州大学旧金山分校和俄国科 学院于1 9 9 6年合作提出的 9 实际是D N A扣除杂 交方法 所谓抑制P C R是利用非目标序列片段两端 的反向重复序列 在退火时产生 锅 柄 结构 无法 与引物配对 从而选择性地抑制非目标序列的扩增 同时根据杂交的二级动力学原理 丰度高的单链 c D N A退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的 单链c D N A 从而使得丰度差别的c D N A相对含量 基本一致 其基本过程是 将c D N A用R s a I或 H a e I I I酶切 以产生大小适当的平头末端c D N A片 段 将实验方c D N A分成均等的两份 各自接上两种 接头 与过量的驱动方c D N A杂交 产生4种产物 a 是单链实验方c D N A b是自身退火的实验方c D N A 双链 c是实验方和驱动方的异源双链 d是自身退 火的驱动方c D N A双链 第1次杂交的目的是实现 实验方单链c D N A均等化 使原来有丰度差别的单 链c D N A的相对含量达到基本一致 第1次杂交后 合并两份杂交产物 再加上新的变性驱动方单链 再 次杂交 此时只有第一次杂交后 经均等化的差异表 达的单链c D N A形成含有不同接头的双链分子 这 次杂交进一步富集了差异表达基因的c D N A 由于 有两个不同的接头 使其在以后的P C R中能够被有 效地扩增 S S H技术与其他技术相比有以下优缺点 速 度快 效率高 一次S S H反应可同时分离几十或上百 个差异表达的基因 阳性率高 S t e i n等 1 0 的研究 发现 S S H的阳性率可达9 4 敏感程度高 由于 S S H用R s a 或H a e 酶切后产生许多c D N A片段 2 4 0 北京医学2 0 0 6年第2 8卷第4期 关于书写中英文摘要和参考文献的说明 本刊要求论著稿件附2 0 0字左右的中文摘要及相应的英文摘要 英译文题 单位英文名称和前三名作 者汉语拼音 并在摘要下写出2 3个关键词 包括英文关键词 为便于通过医学主题词表查阅您的文章 请 参照 医学主题词词表 列出论著的中英文对照的关键词 中 英文摘要请按结构式摘要的形式来写 即目 的 方法 结果 结论四部分 参考文献的作者3位以上务必列出前3位 3位以内全列 不可只列一位加 等 国外文献作者的姓及名字缩写要列齐全 文献在文内引用处一定要全部列出角码 图一定要以读者 看懂为准 凡以上资料不全者将影响文章刊出日程 本刊编辑部 读者 作者 编者 可提高差别D N A的检出率 同时由于S S H中采用 了均等化和富集目标基因片段的方法 也可保证低 丰度m R N A的检出 实验结果复杂程度低 S S H 技术由于采用了接头 差减杂交及两轮抑制性P C R 扩增 可大量扩增那些差异表达的c D N A片段 并可 减少复杂性 S S H的关键点是c D N A与接头的连 接 如果连接效率不高 则难以发现某些有差异表达 的基因 本技术的最大障碍是实验中所需的 m R N A量较大 一般为几微克 因而某些特殊样本不 易获得 可在S S H前将样本进行扩增弥补这一缺点 但此法可导致某些系列片段的丢失 1 1 S S H中的 二次扣除杂交均需要过量的驱动c D N A 可能掩盖实 验方c D N A中某些表达有丰度差别的c D N A S S H技术中所研究材料的差异不宜太大 参考文献 1 L i a n gP P a r d e eA B D i f f e r e n t i a l d i s p l a yo f e u k a r y o t i cm e s s e n g e r R N Ab ym e a n s o f t h ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n S c i e n c e 1 9 9 2 2 5 7 9 6 7 9 7 1 2 S a r g e n t T D D a w i dI B D i f f e r e n t i a l g e n ee x p r e s s i o ni nt h eg a s t r u l a o f X e n o p u s l a e v i s S c i e n c e 1 9 8 3 2 2 2 1 3 5 1 3 9 3 S i v e H L J o h nT S As i m p l e s u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o nt e c h n i q u e e m p l o y i n g p h o t o a c t i v a t a b l e b i o t i n a n d p h e n o l e x t r a c t i o n N u c l e i c A c i d s R e s 1 9 8 8 1 6 1 0 9 3 7 4 S c b r a m l P S b i p m a nR S t u l zP e t a l c D N As u b t r a c t i o nl i b r a r y c o n s t r u c t i o nu s i n g a m a g n e t a s s i s t e ds u b t r a c t i o nt e c h n i q u e M A S T T r e n d s G e n e t 1 9 9 3 9 7 0 7 1 5 H u b a n kM S c h a t z D G I d e n t i f y i n g d i f f e r e n c e s i nm R N Ae x p r e s s i o n b y r e p r e s e n t a t i o n a l d i f f e r e n c e a n a l y s i s o f c D N A N u c l e i c A c i d s R e s 1 9 9 4 2 2 5 6 4 0 5 6 4 8 6 L i s i t s y nN Wi g l e r M C l o n i n gt h ed i f f e r e n c e sb e t we e nt w oc o m p l e x g e n o m e s S c i e n c e 1 9 9 3 2 5 9 9 4 6 9 5 1 7 Y u a nB Z M i l l e r M J K e c kC L e t a l C l o n i n g c h a r a c t e r i z a t i o n a n d c h r o m o s o m a l l o c a l i z a t i o no f a g e n e f r e q u e n t l y d e l e t e di nh u m a nl i v e r c a n c e r D I C 2 1 h o m o l o g o u st or a t R h o G A P C a n c e r R e s 1 9 9 8 5 8 2 1 9 6 2 1 9 9 8 S i e b e r t P D C h e n c h i kA K e l l o g gD E e t a l A ni m p r o v e dP C R m e t h o df o r w a l k i n g i nu n c l o n e dg e n o m i c D N A N u c l e i c A c i d s R e s 1 9 9 5 2 3 1 0 8 7 1 0 8 8 9 D i a t c h e n k o L L a uY F C a m p b e l l A P e t a l S u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n Am e t h o df o r g e n e r a t i n g d i f f e r e n t i a l l y r e g u l a t e do r t i s s u e s p e c i f i c c D N A p r o b e a n dl i b r a r i e s P r