氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性.doc

实验三 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性一、实验目的1、了解氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本原理。2、掌握氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本操作方法。二、实验原理 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 三、材料、仪器设备及试剂 （一）材料 水稻或小麦等植物叶片。 （二）仪器设备 高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000Lx），试 管或指形管数支。 （三）试剂 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。91.5ml0.05MNa2HPO4+8.5ml0.05M NaH2PO4 。（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。 （3）750mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 （4）100mol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。 （5）20 mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。 四、实验步骤 1、酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.52g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为4ml。取4ml于410000r/min离心20min上清液即为SOD粗提液。 2、显色反应 取10mL试管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液： 各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4000lx日光下反应20min（要各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。 3、SOD活性测定与计算 至反应结束后，全部移入暗处，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度。注意：用放在暗处的缓冲液代替酶液的空白管调零，各试剂按比例混合好（3.5ml缓冲液+0.5ml甲硫氨酸+0.5ml氮蓝四唑+0.5ml EDTANa2+0.40ml蒸馏水），再加100ul酶液，核黄素0.5ml最后单独加入。总体积6.0mL表10 SOD活性测定的试剂量试管编号1对照（不光照）2对照（光照）34缓冲液（mL）3.503.503.503.50甲硫氨酸（mL）0.500.500.500.50氮蓝四唑（mL）0.500.500.500.50EDTANa2（mL）0.500.500.500.50蒸馏水（mL）0.500.500.400.40酶液000.100.10核黄素0.500.500.500.50测定结果0AckAE1AE2表11 SOD活性测定（平行测定2次）的Abs试管号2对照（光照）34平行测定次数第一次第二次第一次第二次第一次第二次吸光度A（Abs）0.2030.2510.0550.1990.0350.140五、结果计算 计算公式：SOD（U/g.FW）=(Ack-AE)*VT/Ack/0.5/W/Vs式中VT-总酶液量（ml） Vs-所用酶液量（50ul）W-叶片鲜重 （g）Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度 AE-样品管吸光度表12 SOD活性的计算VT = 400uL