肝脏细胞的分离、培养和鉴定技术.pdf

1994 2010 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 比 玫 丁 涟 一 以 一 一 斌 肛 为的 世界华人消化杂志 一 年版权归世界胃肠病学杂志社 肝脏细胞的分离 培养和鉴定技术 口龚建平 韩本立 主题词肝细胞学细胞分离细胞 培养的 中国图书馆分类号 随着现代细胞学和 分子生物学的研究进展 细胞 的分离 培养和 鉴定技术有了长 足的进步 特别是在肝 脏细胞的分离 培养和鉴定等方面有了很 大的发展 这为深入研究肝脏 的生理 及病理生理提供了重 要 的实验方法 现将其最 新进展作一 综述 肝脏细胞的组成 肝脏细胞由上皮细胞 间质细胞和其他细胞组成上皮细 胞 由肝细胞约占 一 和肝内胆管上皮细胞 一 组成间质细胞包括枯否细胞 肝 窦内皮 细胞 以 肝星状细胞 哭 细胞 成纤维细 胞等 共占肝 脏细胞总数 的 一 其他肝脏细胞还有血管和 淋巴上皮细胞 树状 细 胞及血循环系统 中的红细胞和白细胞等 肝脏细胞分离的基本技术 实验材料及灌注方法小 白鼠 大 鼠 豚鼠等动物及人的 肝脏均可用来分离肝脏细胞 其中大 鼠肝脏是 最常用的实验 材 料各种肝脏灌注的基本方法如下 大 鼠 兔等 中小动物麻 醉 后 经腹部正中切 口进入腹腔 行门静脉顺行插管川 并先灌注 无钙 含氧的前期缓冲灌 注液 灌注 一 后 在 肾静脉 平 面切断下腔静脉 将一根 一 长的塑料管经此处插入肝 上下腔静脉 结扎肝 下 下腔静脉 再用前期缓冲灌注液 灌注肝脏 一 冲洗出肝脏 内的血细胞 和 钙离子 当灌注液完全清亮后 将灌注液改成含有蛋 白水解酶的溶液如 碑的胶原酶和 一 回的 并在 下灌注肝脏至肝组织完全软化 肝包膜下组织液化撕碎肝组 织 剔除门脉系统的结缔组 织及肝包膜 并经 目的钢 网过 滤小鼠等小动物 则可 经右心房插管进入 上 腔静脉逆行灌注 肝脏 而对狗 或人的大 肝脏 则可切除 一 离体灌 注 肝脏灌注过程中可能遇见的问题 及处理方法见有关报 道闭 月 干脏细胞的分离方法肝脏细胞 的分离方法包 括机械分 离法和酶分离法 两种前者是利 用物理方法将肝 脏细胞与肝 内结缔组织及鞘等相分离其优点是操作简单 成本低 和所分离的细胞膜上 的蛋 白质成分性质不易发生改变但是 该方法细胞产量 低 细胞活性也 差 近年来逐渐被 酶分离法所 替代陈 多种蛋 白水解酶可被用来分 离肝脏细胞 其 中最常用 的是胶原酶用胶原酶分 离法可获得较高的细胞产量和活性 细胞 并且其细胞膜上的蛋白质成分能得 到较完整保存但胶 原酶在酶活性及其特异性方面存在很大差异 尽 可能使用 同一 厂家生产的同一批产品一般认为型胶 原 酶最适宜大 鼠 兔等动物肝脏细胞的分离 而胶原酶适 宜人肝的分离 第三军医大学西南医院肝胆外科 重庆市 通讯作者龚建平 收稿日期 一一 修回日期 一 一 细胞纯度和活力鉴定鉴别细胞纯度的方法包 括 形 态 学 生化 组 织化学和免疫组化等技术肝细胞通过形 态学方 法如 大小 形 状等容易鉴别 但 非实质肝细胞如 义 等必须通过特殊的方法才能准确鉴别抓 这 些细胞的纯度随 整个分离过程而发生变化 对污染细胞 的鉴别是精确解释 实验 结果的关键因素最常用的鉴别细胞活力的方法有以下几种 台盼蓝染色是鉴别肝脏细胞活力的最简单 最常见的方法 通过这种方法 容易在光镜下鉴别亮的折光的未染色活性细胞 和染成蓝色的死细胞 可将硝基 蓝四哇 放 于生理性的缓冲液中 活 细胞可 以减 少不溶 解 蓝色 复合体 而死亡细胞无此特性从而将两者区分开 乙 酞荧光素 一种荧光素醋 能渗透到活细胞内而被细胞 内非特 异性的醋酶转化成荧光素 细胞活力也可通过组织细胞化 学和免疫细胞化学等方法来鉴别以乳酶脱氢酶为例 死 亡的 细胞其胞膜完整性 受破坏 乳酸脱氢酶 外溢 而活性细胞乳酸 脱氢酶局限于溶酶体 内总之鉴别细胞产量和活力的方法主 要应根据时间和设备而定 和 是决定细胞大小和 数 量最精确和有效的方法 但其价格 昂贵 所以其使用受到限制 因此 目前光镜是 鉴定细胞数量 活力 细 胞成团的程度及细胞碎片等方面最简单有效的方法 缓冲液的组成分离肝脏细胞的缓冲液离子浓度必须维 持在生理范围尚未有一种单一的缓冲液 是分 离肝脏细胞的 最佳缓冲液 目前 常用的灌注和分离肝 脏细胞的缓冲液有 双碳酸盐缓冲液 朋平衡盐缓冲液和玩 磷酸盐缓冲液肝脏的灌注液可以是一次性使用的 也可以重 复循环使用 一 次性使用的缓冲液的成分和值不受肝脏 代谢产物的影响 但其成本高 操作复杂 使用不方便 因此 常规肝脏灌注的缓冲液均用重复循环的缓冲液 经蠕动泵持续 灌入肝脏灌注过程中缓冲液 的值 范围要求应在 但是由于肝脏的代 谢产物不断进入缓冲液 内 其值可 以下降到以下 结果造成乳酸等酸性代谢产物堆集 影响 分离细胞的活性因此在循环灌注时 应监测缓冲液的值 并用 矛 将其调整到生理范围为了避免在灌 注过程中连续调整缓冲液 的 值 而又能维持其 值在生 理范围内 可 以加 用新鲜日 总量不超过 这 能维持稳定的值 同时对细胞的毒性作用 又较其他缓冲液 小如果 用碳 酸氢根 离子调整 灌注液的值 时 也可以用 毛连续供气来维持缓冲液的 值恒定川 有作者报道可在缓冲液中加入 一 葡萄糖 丙酮酸钠 一 谷氨酸等营养物质可增加 肝脏细胞的活力然而这 些物质在 维持细胞 完整性方面的作用有待进一步评价在前期灌注时 无 十 缓冲液会增加细胞的产量 但是 随后应加入缓冲 液中 如果无公 溶液灌注时间超过 肝细胞将 出现不 可逆 的损害另外 十 将显著增加胶原酶 的水解蛋 白质的 能力 在应用 二 时 也需加 十 和 才 这两种离子对此酶 具有稳定作用 不同肝脏细胞亚群的分离技术及其评价根据肝 脏细胞 不同亚群的异质性和其物理结构具有重叠性 可将不同的肝 脏 细胞亚群进行分类 其常用的分类方法有 以下几种 不同的离心分离法离心技术是根据不同肝脏细胞亚 群之间形 态 大小 和密度的不同而将其分离离心技术又包括 八 勺 1994 2010 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 一卜 一 世界华人消化杂志年月第卷第期 简单的速度沉析到复杂的电脑控制下的多种密度梯度离心法 尽管离心沉析法能在绝大多数临床实验室完成 但所得到的细 胞产量不高 纯度也不符合实验要求因此细胞分离技术最好 根据不同细胞亚群形 态 大小和 密度的不同而采取综合 的离心 技术其中 汕 介绍的不连续密度梯度离心法是 最为简单有效的方法 选择性粘附分离法利用细胞选择性地粘附到固体表 面如组 织培养皿上的特性分离特殊的肝脏细胞是一项十分有 用的技术这一方法简单 方便 成本低 其基本原理是根据不 同的细胞粘附到塑料或玻璃上的性质不同而定的 反映了细胞 不同的理化性质和细胞表面电荷的不同 该方法常用来将 细胞与其他肝脏细胞相 分离 表面负责粘附到塑料或玻璃 表面的受体已经用单克隆抗体证实在各种肝脏细胞亚群中 是最先粘附到固体表面的 这可将从内皮细胞及其他 肝脏细胞中相分离 双相水聚合物提取法水的双相提取法系统 由两种水 溶性聚合物组成 最常用的物质是葡聚糖和 卜 当两者按照 一定比例混合后 形 成一种等渗压的双相液体 系统 葡聚糖正 常沉析在试管底部 而分布在试管顶部 当与细胞混合 后 在离心期间两相分开 细胞分别进入其中一相或在两相交 界之 间 几种参数可以控制两相中的细胞 分 部 例如根据电荷 密度 疏水性和 免疫性能的不同而将不同细胞相 分离有 时 将抗体连接在上 含有特殊抗原的细胞就会 聚集在 相可通过改变聚合体的浓度或其离子成分如通过加磷酸离 子或氯化钠而调整这两相系统的物理性能根据细胞表面电 荷的相互作用和胞质膜成分 与由葡聚糖和 组成的双相系 统弱的化学作用 将肝细胞 与相分离该技术对细胞 分离十分有效 但所得的细胞活力较低 流式细胞技术法利用荧光激活细胞分类仪 一 是肝脏不同细胞亚群定性和 纯 度分析非常有效的方法之一 任何能被荧光素标记 细胞无 论是在细胞内或细胞膜上 均能用检测常用的荧光试 剂为氢化荧光素 诺丹明司相连接的抗体 和其他配 体 这些物质均能标记个体细胞以便于研究细胞表面的免疫荧 光物质 细胞 内的值和 十 浓度细胞 悬液 能常规被不同 的荧光素探针染色 同时独立地分析每一种荧光色素碘化物 是一种荧光素化合 物 能结合到死 亡细胞 的 上 所以能用来评定细胞 的活力是分析混合肝 脏细胞 悬液的一种重要工具 它通过分析不同细胞亚群的物理及免疫 性质而确定细胞 的纯度但是该 方法由于有以下缺点而限制 了它的广泛使用闭 相对低的细胞产量 较慢的细胞 筛选 率了 设备 昂贵并需要较高的技术培训 一 在区别不同细胞亚 群中是一种十分敏感的方法 它能通过细胞微细的差异如细胞 表面微小的电荷差别而鉴别不同的细胞亚群 所以常用 它来区 分完整的活细胞与死亡的细胞 细胞核和细胞碎片沁 因为不 同的细胞或细胞成分在电泳板中迁移率不同其实验条件如 缓冲液的组成及灌注速度 温度和电压等应根据分离细胞的类 型而定虽然可用来分离包括胆管细胞在内的所有肝脏 细胞 但该方法所需设备昂贵 分离时间较长 实际应用价值有 待进一步评价 选择性的细胞毒分离法选择性的细胞毒分离法常用 来将肝细胞从肝脏细胞混合 悬液中分离出来通常用 蛋白水 解酶如链霉蛋白酶 胰蛋 白酶和 内毒素均可引起肝细胞选择性 地溶解 这种选择性的细胞毒分离法常用来将肝实质细胞与其 他非肝脏实质性细胞相分离纽 可通过门静脉 腔静脉肝 静脉等途径灌注毒素以破坏门静脉 或肝中央静脉周围的肝细 胞以获得其他非肝实质性细胞灌注的毒素有洋地黄毒普 澳 苯 四氯化碳 乙醇 丙 烯醇等 各种肝脏细胞的特性及分离特点 为了精确研究各种不同肝脏细胞的结构和功能 常需利用 肝细胞的特性分离培养出不同的肝脏细胞 并需获得一定的细 胞纯度和细胞活性 其中最常分离的肝 脏细胞有肝细胞 二 细胞 和胆管细胞 在这些细胞 的分离过程 中 必须注意几个 问题 分离过程可能改变细胞膜的组成成 分 在分 离过程中 细胞 的功能可能因细胞 与墓底膜或细胞 与细胞 间的结构关系改变而改变 分离的细胞 与在肝脏的原 位细胞相比 对各种刺激的反应可能发生改变 月 干细胞肝细胞占整个肝脏细胞总数的 一 它 位于肝脏的肝小 叶内 与细胞外基质疏松连接 因此 用 一 创胶原酶经门静脉灌注肝脏极易将肝细胞分离出来 在分离肝细胞时 其灌注速度必须精确计算 灌注速度过低 可 能引起肝细胞缺氧 而灌注速度过快 可能导致肝细胞机械 性 损害 最理想的灌注速度是每分钟 一 灌注液 通过 一 肝脏组织 这 能维持静水压在 一 之间肝 脏被酶消化后 首先清除肝被膜及妙系统内的纤维结缔组 织 这不仅便于 肝细胞的收集 也有利于增加 肝细胞 的纯度 肝脏被酶消化完全的指征是肝被膜能轻易地被去除 若消化不 全 肝被膜坚韧而难 以去除相反 若酶消化过度 肝被膜易被 撕成碎片另外 加 入工 目 一 和 才 离子可减少因细胞破坏后释放所致的细胞团聚肝细胞 的纯度可通过常规的 细胞化学染色确定 也可用免疫组化 的方法通过测定其特有 的酶葡萄糖 一一 磷酸酶和清蛋 白而 鉴别肝细胞 的有些酶如 和 驭 等在不同区带 的肝细胞中存在异质性分布 这与不同区带肝细胞 的解剖结构 和血液供应不同有 密切关系川例如 在门脉区 由于氧供丰 富 该区肝细胞 内与能量代谢和氨基酸代谢有关的酶就 明显增 多 而在中央静脉区 由于氧分压低 该区肝细胞内与糖 脂代 谢有关的酶就增加 因此 可以根据肝脏不同区带肝细胞的异 质性将两个区带的肝细胞分别分离出来 一种分离不同区带 肝细胞 的方法是先用洋地黄皂普分别灌注门静脉或 下腔静脉丫肝静脉 以溶解该区域 的肝细胞 再用胶原酶灌注肝 脏 终止洋地黄皂普对另一区域肝细胞的溶解作用 并收集得 到该区域未被破坏的游离肝细胞也有作者报道可用荧光抗 体标记到不同区带的肝细胞 的特异性抗原上 或用叮咤橙选择 性地对不同区带的肝细胞进行染色 然后 用将两区带的 肝细胞进行分 离 枯否细胞是网状内皮系统的重要组成部分 具有典 型的星状突起 占非肝实质细胞总数的 一 主要位于 门脉区肝窦内 与 义 和肝细胞紧密联系 具有清除细菌 及其毒素 分 泌多种细胞因子和参与抗原递呈等多种作 用鉴 别的方法有以下几点 在形 态学上 因能吞噬印度墨 质 胶体碳及胶乳颗粒等易被鉴别 川 在细胞化学上 因其含 有过氧化氢酶及耐受酒 石酸的酸性磷酸酶也易与其他细胞相 区别 在免疫细胞化学上 由于膜上存在一种特殊抗原 一