微量量热法研究清开灵注射液对金黄色葡萄球菌代谢的影响.doc

基金项目 国家杰出青年科学基金项目 30625042 国家中医药管理局研究专项 06 072P58 国家自然科学基金面上项目 30701109 作者简介 武彦舒 男 1983 年生 陕西榆林人 中药学硕士 主要从事中药质量标准研究及品质评价 TelE mail wys0102 通讯作者 肖小河 Tel 010 66933322 E mail pharmacy302 杜晓曦 E mail duxx 1 微量量热法研究清开灵注射液对金黄色葡萄球菌代谢的影响 武彦舒 1 2 张 倩1 2 金 城1 鄢 丹1 肖小河1 杜晓曦3 王 建2 1 解放军 302 医院 全军中药研究所 北京 100039 2 成都中医药大学 药学院 成都 611137 3 国家食品药品监督管理局 药品审评中心 北京 100038 摘摘 要要 目的目的 研究清开灵注射液对金黄色葡萄球菌生长代谢的影响 探索建立 基于生物评价的清开灵注射液质控新方法 方法方法 采用微量量热法 考察药物 作用于细菌的生物热效应 对所测得的热功率输出曲线进行对比分析和计算机 拟合 抽提有效参数 得出系列热动力学参数信息 结果结果 在一定范围内 0 150 L 随剂量增加 金黄色葡萄球菌生长曲线呈 下降 后延 趋势 且参数 T1 T2 K1 P1 P2 I 均与剂量呈较好的线性关系 清开灵注射液对 金黄色葡萄球菌的半数抑菌量为 97 698 L 最佳抑菌量为 164 L 不同厂家及 同厂家不同批次清开灵注射液样品的生长曲线存在不同程度差异 结论结论 清开 灵注射液对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用 微量量热法可作为清开灵注射 液的质量评价的一种新方法 关键词 关键词 微量量热法 清开灵注射液 金黄色葡萄球菌 热功率输出曲线 Microcalorimetric study on the metabolic action ofstaphylococcus aureus affected by Qingkailing Injection WU Yan shu1 2 ZHANG Qian1 2 JIN Cheng1 YAN Dan1 XIAO Xiao he1 DU Xiao xi3 WANG Jian2 1 PLA Institute of Chinese Materia Medica 302 Hospital of PLA Beijing 100039 China 2 Pharmacy College Chengdu University of TCM Chengdu 610075 China 3 Centre for Drug Evaluation SFDA Beijing 100038 China Abstract Objective To investigate the metabolic action of staphylococcus aureus affected by Qingkailing Injection and search for new method based on 2 biological assessment Methods The growth thermogenic curves were determined by microcalorimetry and analyzed by computer Results In the concentration range of 0 150 L the growth thermogenic curves of staphylococcus aureus were declined and removed back with increasing dosage of Qingkailing Injection The main parameters K1 P1 P2 T1 T2 I and the dosage of Qingkailing Injection have good correlation The 50 inhibiting quantity is 97 698 L and the optimal inhibiting quantity is 164 L There were something differences of Qingkailing Injection from different factories and different batches Conclusion It was proved that Qingkailing Injection can inhibit metabolic action of staphylococcus aureus the microcalorimetry could be applied to the quality accessment of Qingkailing Injection Key words Microcalorimetry Qingkailing Injection staphylococcus aureus growth thermogenic curves 清开灵注射液是传统名方 安宫牛黄丸 的改良剂型 由胆酸 珍珠母 粉 猪去氧胆酸 栀子 水牛角 粉 板蓝根 黄芩苷 金银花 8 味中药 组成 1992 年始清开灵注射液被政府医药管理部门指定为全国中医医院急诊 科 室必备的中成药 主要用于热病 神昏 中风偏瘫 神志不清 急性肝 炎 上呼吸道感染 肺炎 脑血栓形成 脑出血见上述证候者 1 临床疗效确 切 但同时引发的药物不良反应 ADR 在发生 ADR 的中药制剂中位列第二 2 国家食品药品监督管理局 SFDA 针对已上市的中药注射剂明确要求 建立生物活性检测方法 以弥补目前检验指标仅仅能控制已知成分的不足 从 生物活性角度控制药品的质量 3 中药质量生物控制已成为中药质量控制研究 发展的趋势 4 现代药理研究表明 清开灵注射液主要有解热镇静 抗菌 抑毒保肝 抗 凝促溶 免疫调节等作用 5 临床上 清开灵注射液用于热病 急性上呼吸道 感染及肺炎的频率很高 6 这与清开灵注射液良好的抗菌作用密不可分 结合 前期研究 7 本文以清开灵注射液的抗菌作用为着眼点 采用微量量热法 对 清开灵注射液影响金黄色葡萄球菌代谢的作用进行初步研究 为清开灵注射液 质量的生物评价与控制的后续工作做了必要的铺垫 3 1 实验仪器及材料实验仪器及材料 1 1 实验仪器实验仪器 实验仪器采用瑞典 Thermometric 公司产的 LKB 2277 生物热活性检测系统 LKB 2132 蠕动泵 实验时系统控温 37 有关仪器的结构原理见文献 8 1 2 实验材料实验材料 金黄色葡萄球菌 CCTCC AB910393 由武汉大学中国典型培养物保藏中心提 供 清开灵注射液样品由具代表性的两个大厂家 BZY SXTH 提供 各 3 批 样品 批次分别为 811601 712604A 710510A 070930 071120 071219 培养基为 LB 培养基 取蛋白胨 10 g 酵母粉 5 g 氯化钠 5 g 溶于 1000 mL 蒸馏水中 pH 7 2 分装后于 121 高压蒸气灭菌 20 min 置 4 冰箱中备 用 2 方法与结果方法与结果 2 1 实验方法实验方法 采用停流法检测 测定前分别用适量 0 1 mol L 1氢氧化钠 0 1 mol L 1盐 酸 75 乙醇溶液和无菌水清洗管道和流通池 待仪器得到稳定的基线后 用 蠕动泵以 50 mL h 1的流速 将菌液和清开灵注射液混合液泵入微量热计中 当 样品充满流通池后停泵 启动采集卡开始采集数据 跟踪记录流通池内细菌生 长的产热曲线 P t 曲线 当采集的数据重新回到基线后 实验结束 根据实验要求 将一定量的清开灵注射液加入到接种了金黄色葡萄球菌的 培养液中 使菌含量为 2 106 cells mL 1 用振荡器混匀 以备进样 整个过程 为无菌操作 2 2 结果与讨论结果与讨论 2 2 1 金黄色葡萄球菌的生长热功率输出曲线金黄色葡萄球菌的生长热功率输出曲线 4 图 1 金黄色葡萄球菌完整代谢曲线 Fig 1 Metabolism curve of Staphylococcus aureus 图 1 是 37 下 停流法测定的金黄色葡萄球菌完整代谢曲线 曲线 A P t 曲线 是所测定的细菌生长曲线 可以分成四个阶段 停滞 期 指数生长期 稳定期和 衰亡期 分别对应于细菌对培养基中不同营 养成分的利用情况及不同的代谢过程 9 与传统方法测定的细菌代谢曲线相似 曲线 B lnP t 曲线 则显示了线性拟合后细菌代谢热功率输出随时间的变 化特征 10 2 2 2 重现性考察重现性考察 采用微量量热之停流法测定金黄色葡萄球菌生长热谱曲线 在相同的实验 条件下 P1 P2 K1 T 的 RSD 值分别为 3 468 4 4739 2 4161 0 9413 说明实验结果具有良好的重现性 2 2 3 清开灵注射液不同剂量对金黄色葡萄球菌代谢的影响清开灵注射液不同剂量对金黄色葡萄球菌代谢的影响 见图 2 5 图 2 金黄色葡萄球菌浓度梯度图 Fig 2 Concentration gradient curves of staphylococcus aureus 用 SXTH 的批次为 071120 样品 分别考察了 0 200 L 的 8 个浓度梯度 线性关系良好 当剂量增加到 200 L 时 金葡菌生长曲线已严重变形 不再适 用于指数生长模型 见图 2 曲线 a 定义药物对细菌的抑制率为 I k0 kV k0 100 式中 k0为剂量为零时 细菌生长代谢的速率常数 kV为细菌受到剂量为 V 的药物抑制时的速率常数 由此计算出金黄色葡萄球菌在清开灵注射液不同剂量下的抑制率 I 作 V I 图 求得半数抑菌量为 97 698 L 当 K1 为 0 时 细菌完全停止生长 求得最佳抑菌量为 164 L 细菌传代时间 tG ln 2 k 详细参数见表 1 表 1 不同剂量清开灵注射液对金黄色葡萄球菌生长曲线参数影响 Table 1 Effect of Qingkailing Injection of different dosage on parameters 6 剂量 V L T1 min P1 w Q1 mJ K1 min 1 T2 min P2 w Q2 mJ Qt mJ T min tG min I 019630 66163 9950 0342644432 468242 125378 01124820 232 2520428 30568 8630 0275346230 191278 888402 65425825 1780 196 5020622 40354 8850 0245148626 437268 776359 54228028 2800 285 7521017 78952 3410 0205554222 592285 151374 26333233 7300 400 10021213 66447 8570 0170259819 904299 357388 40438640 7250 503 12521611 37346 2720 0138964018 666322 248408 58542449 9030 595 1502209 19459 5040 0090967416 115369 840492 00845476 2540 735 相关系数0 9850 9890 6080 9940 9890 9910 9360 6760 9850 9280 998 T1 为指数生长期达峰时间 T2 为稳定期达峰时间 T 为稳定期与指数生长期达峰时间差 P1 为指数 生长期最大热功率 P2 为稳定期最大热功率 K1 为指数生长期生长速率常数 I 为药物对细菌抑制率 tG为细菌传代时间 Q1 为指数生长期发热量 Q2 为稳定期发热量 Qt 为总发热量 由图谱及参数分析 发现在一定范围内 0 150 L 随清开灵注射液剂量 增加 金黄色葡萄球菌生长曲线整体呈 下降 后延 趋势 细菌指数生长期 速率常数 K1 最大热功率 P1 稳定期最大热功率 P2 均相应减小 指数生长期 达峰时间 T1 稳定期达峰时间 T2 稳定期与指数生长期达峰时间差 T 药物 对细菌抑制率 I 均相应增大 且均与剂量呈较好的线性关系 r 分别为 0 994 0 989 0 991 0 985 0 989 0 985 0 998 细菌传代时间 tG也相应增 加 而细菌第一指数生长期发热量 Q1 整体略呈下降趋势 稳定期发热量 Q2 总发热 量 Qt 整体略呈上升趋势 但相关性较差 r 分别为 0 608 0 936 0 676 2 2 4 不同清开灵注射液样品热谱图初步分析不同清开灵注射液样品热谱图初步分析 在以上系列浓度中 选择和空白相比参数变化较大 但图谱不发生明显变 形的浓度 50 L 对清开灵注射液不同样品的抑菌效果进行了测试 见图 3 7 图 3 不同清开灵注射液样品对金黄色葡萄球菌的影响 实线 BZY 虚线 SXTH Fig 3 Effect of Qingkailing Injection on metabolism of staphylococcus aureus Solid line BZY Dash line SXTH 上图中 实线所示图为 BZY 清开灵注射液生长曲线图 虚线所示图为 SXTH 清开灵注射液生长曲线图 显然 BZY SXTH 两个厂家间的样品生长 曲线有很大的差异 BZY 样品的稳定期较 SXTH 样品多一个峰 如图所示峰 b 且 P1 也较 SXTH 样品大 上图所示区域 稳定期 可见 BZY 批次为 811601 的样品生长曲线明显 区别于其他样品 见上图标示的峰 a 明显高于其他样品 SXTH 的 3 批次样品 生长曲线差异较小 由此可见 不同厂家 同厂家不同批次清开灵注射液质量存在不同程度的 差异 2 2 5 讨论讨论 2 2 5 1 本实验首次通过微量量热法较系统的研究了清开灵注射液对金黄色葡萄 球菌代谢作用的影响 得出其抑菌效应 这与文献报道一致 并得出其半数抑 菌量 97 698 L 和最佳抑菌量 164 L 2 2 5 2 在特定条件下 药物作用于细菌的生长曲线是相对稳定的 且与活性相 关 因此我们称之为 生物热活性指纹图谱 Bio activity Fingerprint 通过分 析 发现在相同条件下 清开灵注射液不同厂家以及同厂家不同批次间样品的 生物热活性指纹图谱存在不同程度的差异 在一定程度上反映了清开灵注射液 8 质量的差异性 2 2 5 3 清开灵注射液作用于金黄色葡萄球菌的生物热活性指纹图谱提示我们 微量量热法在研究清开灵注射液质量一致性方面有很好的苗头 进而为从活性 角度评价清开灵注射液的质量提供了很好的思路 2 2 5 4 微量量热检测技术具有普适性好 实时在线 客观灵敏 定性定量 经 济高效等特点 符合中药药效与质量评价的客观现实和发展方向 有利于中药 质量控制和药效评价等复杂性难题 在理论上比现行的中药指标性成分定性定 量分析具有较明显的优越性 4 2 2 5 5 本研究仅针对清开灵注射液的抑菌作用进行了初步