蛋白质提取综合性实验.doc

生物化学综合性实验蛋白质的提取（沉淀法）和定量分析之鸡蛋中卵清蛋白的提取和定量测定一、实验目的研究盐析沉淀和等电点沉淀法的基本原理和技术。一、 二、实验原理1、沉淀法粗分离蛋白质12沉淀法是分离纯化生物大分子物质常用的一种经典方法，可分盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法等。蛋白质分子表面含有带电荷的基团，这些基团与水分子有较大的亲和力，故蛋白质在水溶液中能形成水化膜，增加了蛋白质水溶液和稳定性。如果在蛋白质溶液中加入大量中性盐， 导致蛋白质分子表面电荷被中和，水化膜被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出，这就是盐析作用。由于各种蛋白质分子表面的极性基团所带电荷数目不同，它们在蛋白质表面上的分布情况也不一样，因此，将不同蛋白质盐析出来所需要的盐浓度也各异，盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合液中的各个成分分步盐析出来，达到粗分离蛋白质的目的。盐析法是1878年Hammarster首次使用的，可用作盐析的中性盐有过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸铵等，其中应用最广的是硫酸铵，硫酸铵在水中溶解度大，25可达4.1mol/L的浓度，化学性质稳定，溶解度的温度系数变化较小，价廉易得；分段效果较其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。鸡蛋清的主要成分是球蛋白和白蛋白（卵清蛋白），球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。蛋白质的盐析作用是可逆过程，由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，因而可初步纯化蛋白质。等电点沉淀法是利用蛋白质在其等电点时溶解度最小来分离具有不同等电点蛋白质的方法。蛋白质是两性电解质，蛋白质分子的电荷性质和数量因PH不同而变化，蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀，因此，在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。卵清蛋白的等电点为4.6-4.8，而球蛋的等电点是5.1。 2、蛋白质的测定根据蛋白质的物理化学性质，测定蛋白质的方法有凯氏定氮法、紫外吸收法、Folin-酚法、考马斯亮蓝G-250染色法等。由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 由于核酸在280波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处，如同时测定260nm的光吸收，通过计算可能消除其对蛋白质测定的影响，因此溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm之光密度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱色谱分离中）广泛应用。此法的缺点是（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。三、材料、试剂与器具1、材料 新鲜鸡蛋2、试剂 饱和硫酸铵、硫酸铵结晶、生理盐水、1mg/mL标准牛血清白蛋白液3、器具 TU180紫外分光光度计、离心机、恒温水浴锅、冰箱、电子天平四、实验步骤23（一）、鸡蛋清清蛋白的提取5mL鸡蛋清（20） 5mL生理盐水（20）稀释液（以减少共沉淀） 逐滴加入10mL饱和硫酸铵溶液 边加边搅拌，饱和度为50%静置10min 3000r/min离心15min 弃沉淀 上清液 加入硫酸铵固体至不溶解为止静置10min 3000r/min离心15min弃上清液 沉淀 10mL生理盐水（20） 溶解 用0.1mol/L醋酸调pH=4.6-4.8（卵清蛋白等电点） 静置10min 3000r/min离心15min 弃上清液 沉淀（卵清蛋白晶体） 5mL生理盐水（20） 溶解（粗产品于20以下保存）（二）、紫外吸收法测定卵清蛋白的含量11、标准曲线法（1）标准曲线的绘制 按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。试管号试剂123456789提取液标准蛋白溶液/mL00.51.01.52.02.53.04.01.0蒸馏水/mL4.03.53.02.52.01.51.003.0蛋白质浓度/mg/mL00.1250.250.3750.500.6250.751.0A280（2）蛋白提取液中蛋白质含量测定提取液分别稀释1倍、10倍、20倍后，取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出经稀释的待测蛋白质的浓度。2、其他方法将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm和280nm处分别测出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质浓度。计算蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260式中A280和A260分别是该溶液在280nm和260nm波长下测得的光吸收值。五、思考题1、为什么蛋白质提取过程须在20以下进行？2、为什么调节等电点一定要准确？3、除本实验的提取方法外，还可用哪些方法进行提取鸡蛋清中的卵清蛋白？六、实验报告1、根据实际操作，以流程图形式总结卵清清蛋白的提取方法；2、绘制标准曲线，用以上两种方法求出5mL鸡蛋清所含清蛋白的量；3、对实验结果（包括现象和数据处理结果）进行分析。七、参考文献1、许秀珍，梁山编，生物化学与分子生物学实验指导，广州：暨