定量PCR的数学和化学原理.pdf

欢迎参加 定量PCR用户培训班 欢迎参加 定量PCR用户培训班 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 定量PCR培训班日程定量PCR培训班日程 9 00 9 40 定量PCR的数学和化学原理张远涛9 00 9 40 定量PCR的数学和化学原理张远涛 9 40 10 30 定量PCR实验要素和数据处理张远涛9 40 10 30 定量PCR实验要素和数据处理张远涛 10 30 10 45 休息10 30 10 45 休息 10 45 11 15 10 45 11 15 引物 探针设计技巧引物 探针设计技巧张远涛张远涛 11 15 12 00 绝对定量和相对定量软件操作张远涛11 15 12 00 绝对定量和相对定量软件操作张远涛 12 00 14 00 工作午餐12 00 14 00 工作午餐 14 30 15 00 定量PCR实验故障排除张远涛14 30 15 00 定量PCR实验故障排除张远涛 15 00 15 15 休息15 00 15 15 休息 15 15 16 00 讨论张远涛15 15 16 00 讨论张远涛 定量定量PCR数学和化学原理数学和化学原理 张远涛张远涛 Application Specialist MCB cnmcbsupport AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 定量PCR数学原理定量PCR数学原理 定量PCR化学原理定量PCR化学原理 等位基因鉴定原理等位基因鉴定原理 定量PCR光学原理定量PCR光学原理 内容提要内容提要 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 定量PCR仪家族定量PCR仪家族 第一代第一代 7700 57007700 5700 第二代第二代 7000 79007000 7900 第三代第三代 7300 75007300 7500 第四代第四代 stepone plusstepone plus AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 AB s Real Time PCR System Portfolio 7500 Fast 7900HT 7500 7900HTA 7300 Features 5 Color 4 Color 384 Well Feature Loaded Price StepOne Gold Standard Real Time PCR System Maximum performance in the minimum time high quality results in as little as 30 minutes The most affordable 96 well real time PCR system from Applied Biosystems The easiest to use real time PCR system from Applied Biosystems StepOne Plus A powerful platform for labs requiring superior performance and maximum dye versatility Easiest to use 96 well real time PCR system with Veriflex and fast for flexibility AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 9个数量级 融解曲线 9个数量级 融解曲线 精良的性能精良的性能 1倍分辨率 相对定量软件 1倍分辨率 相对定量软件 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 功能一览功能一览 绝对定量绝对定量 Absolute Quantification Absolute Quantification 相对定量相对定量 Relative Quantification Relative Quantification 突变分型突变分型 Allelic Discrimination Allelic Discrimination 定性检验定性检验 Plus Minus with IPC Plus Minus with IPC AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 定量PCR的数学原理定量PCR的数学原理 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 什么是PCR什么是PCR R primer R primer F primer F primer 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 3 链式反应的雪崩效应链式反应的雪崩效应 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 3 模板 引物 模板 引物 dNTP 缓冲液 镁离子缓冲液 镁离子 DNA 聚合酶聚合酶 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 PCR动力学曲线和四个阶段PCR动力学曲线和四个阶段 平台期 线性增长期 基线期 指数增长期 平台期 线性增长期 基线期 指数增长期 对数图谱对数图谱 平台期 线性增长期 基线期 指数增长期 平台期 线性增长期 基线期 指数增长期 线性图谱线性图谱 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 lg DNA 循环数循环数 线性期线性期 指数期指数期 PCR理论方程PCR理论方程 N N0 x 1 e nN N0 x 1 e n N 产物分子数 NN 产物分子数 N0 0 起始分子数 e 扩增效率 n 循环次数 起始分子数 e 扩增效率 n 循环次数 PCR理论方程只在指数期成立 理论方程只在指数期成立 N N0 x 1 e n AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 同一个样品重复96次同一个样品重复96次 起点定量与终点定量起点定量与终点定量 终点定量终点定量 起点定量起点定量 起点 样本中原始的DNA量 更有意义 终点 经过PCR 放大的DNA量 起点 样本中原始的DNA量 更有意义 终点 经过PCR 放大的DNA量 起点 误差小 终点 误差大起点 误差小 终点 误差大 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 基线阈值CT值 DNA 0 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 CT值值 基 线基 线 阈值阈值 基线调整规则基线调整规则 如果CT值 18 不需调整 使用自动分析结果 如果CT值 18 不需调整 使用自动分析结果 如果CT值 18 接受默认分析结果 3 如果C 值 18 接受默认分析结果 3 如果CT T值 18 基线终点改成 最小的C值 18 基线终点改成 最小的CT T值值 4 重新分析一次 4 重新分析一次 推荐的手工分析方法推荐的手工分析方法 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 定量PCR的化学原理定量PCR的化学原理 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 两种化学两种化学 探针探针 TaqMan TaqMan TaqMan MGBTaqMan MGB 染料染料 SYBR Green ISYBR Green I AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 TaqMan探针TaqMan探针 3 5 RQ 3 3 5 5 3 5 5 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 TaqMan MGB探针TaqMan MGB探针 NFQMGBR报告荧光无荧光淬灭基团小沟结合物报告荧光无荧光淬灭基团小沟结合物 GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC AGGCCTTGAGAGATAT R Q AGGCCTTGAGAGATAT R Q non fluorescent quencher NFQ Q MGB minor groove binder 提高探针提高探针Tm值值 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 提高探针Tm值 长15碱基 提高 18 C 提高探针Tm值 长15碱基 提高 18 C 缩短探针长度 最佳范围13 21 碱基 缩短探针长度 最佳范围13 21 碱基 定量更多基因定量更多基因 提高探针Tm值提高探针Tm值 长15碱基 提高 18 C长15碱基 提高 18 C 缩短探针长度缩短探针长度 最佳范围13 21 碱基最佳范围13 21 碱基 定量更多基因定量更多基因 减少背景 淬灭基团没有荧光 减少背景 淬灭基团没有荧光 提高信噪比 即使报告信号强度不变 提高信噪比 即使报告信号强度不变 提高淬灭效率提高淬灭效率 减少背景减少背景 淬灭基团没有荧光淬灭基团没有荧光 提高信噪比提高信噪比 即使报告信号强度不变即使报告信号强度不变 提高淬灭效率提高淬灭效率 MGB探针的优点MGB探针的优点 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 荧光共振能量转移 FRET 荧光共振能量转移 FRET 当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠 且两 个基团距离足够近时 能量可以从短波长 高能量 的荧光基团传 递到长波长 低能量 的荧光基团 这个过程称为荧光共振能量转 移 FRET 实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽 当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠 且两 个基团距离足够近时 能量可以从短波长 高能量 的荧光基团传 递到长波长 低能量 的荧光基团 这个过程称为荧光共振能量转 移 FRET 实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 探针信号 DNA拷贝数探针信号 DNA拷贝数 reverse primer RQ forward primer 3 3 5 5 3 5 5 1 退火 开始聚合退火 开始聚合 prob e R Q 3 3 5 5 3 5 5 2 遇到探针遇到探针 Q 3 3 5 5 3 5 5 3 Taq酶的酶的5 3 外切活性外切活性 R 3 5 5 3 5 5 4 聚合完成聚合完成 Q R R 报告基团报告基团Reporter Q 淬灭基团淬灭基团Quencher 3 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 SYBR Green染料SYBR Green染料 SYBR Green I 是一种DNA小沟结合染料SYBR Green I 是一种DNA小沟结合染料 与DNA结合时发光 游离时不发光 与DNA结合时发光 游离时不发光 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 融解曲线 Dissociation curve 融解曲线 Dissociation curve 导数图谱 原始图谱 导数图谱 原始图谱 只有染料法才需要做融解曲线 探针法没必要只有染料法才需要做融解曲线 探针法没必要 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 特异PCR的融解曲线特异PCR的融解曲线 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 染料法的优缺点染料法的优缺点 成本低成本低 不需要探针不需要探针 灵敏度高灵敏度高 Power SYBR能检测2个拷贝起始模板Power SYBR能检测2个拷贝起始模板 适合初步筛查适合初步筛查 先SYBR筛查 再对少数关键样品用探针法精确定量先SYBR筛查 再对少数关键样品用探针法精确定量 兼容熔解曲线兼容熔解曲线 鉴定PCR杂带 引物二聚体鉴定PCR杂带 引物二聚体 特异性问题特异性问题 不能分辨主带与杂带 给出所有双链DNA的总信号不能分辨主带与杂带 给出所有双链DNA的总信号 多重定量问题多重定量问题 每孔只能定量一个基因每孔只能定量一个基因 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 多重荧光定量多重荧光定量 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 多重荧光定量多重荧光定量 原理原理 同一样本 多对引物 分别扩增不同靶基因 不同的探针识别不同的靶基因 不同的探针标记不同的颜色 同一样本 多对引物 分别扩增不同靶基因 不同的探针识别不同的靶基因 不同的探针标记不同的颜色 特点特点 一次提取DNA RNA 一次反应 定量多个基因 要保证信号之间互不干扰 一次提取DNA RNA 一次反应 定量多个基因 要保证信号之间互不干扰 目的目的 提高效率 节省时间 降低研究成本 提高效率 节省时间 降低研究成本 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 荧光染料组合荧光染料组合 报告荧光 报告荧光 6 FAM SYBR Green 6 FAM SYBR Green JOE VICJOE VIC NED CY3 NED CY3 Texas Red CY5 Texas Red CY5 淬灭荧光 淬灭荧光 TAMRA TaqMan探针 None MGB探针 参比荧光 TAMRA TaqMan探针 None MGB探针 参比荧光 ROXROX 推荐的4色组合推荐的4色组合 FAM目的基因1FAM目的基因1 VIC目的基因2 内对照VIC目的基因2 内对照 NED目的基因3NED目的基因3 ROX参比荧光ROX参比荧光 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 7000 FAM SYBR Green I报告荧光报告荧光1 染料染料 VIC JOE报告荧光报告荧光2 TAMRA 淬灭荧光淬灭荧光 ROX 参比荧光参比荧光 7900 FAM SYBR Green I报告荧光报告荧光1 染料染料 VIC JOE报告荧光报告荧光2 NED TAMRA 报告报告 淬灭荧光淬灭荧光 ROX 参比荧光参比荧光 推荐的染料组合推荐的染料组合 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 7300 FAM SYBR Green I VIC JOE TAMRA NED ROX 参比荧光参比荧光 7500 FAM SYBR Green I VIC JOE NED TAMRA CY3 Dye ROX 参比荧光参比荧光 Texas Red CY5 Dye 推荐的染料组合推荐的染料组合 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 推荐的染料组合推荐的染料组合 SteponeStepone FAMFAM SYBR SYBR Green IGreen I VICVIC JOE JOE ROXROX 参比荧光 参比荧光 Stepone PlusStepone Plus FAMFAM SYBR SYBR Green IGreen I VICVIC JOE JOE NEDNED TAMRA TAMRA ROXROX 参比荧光 参比荧光 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 等位基因鉴定等位基因鉴定 AB CONFIDENTIAL 2007 Applied Biosystems 定量PCR的数学和化学原理 等位基因鉴定机理等位基因鉴定机理 野生型野生型 wt 突变型突变型 mut AB CONFIDENTIAL 2007 A