细胞工程_植物细胞培养介绍.doc

第二节 植物细胞培养的方法植物细胞的培养方法：根据培养基的类型分为:1、固体培养: 琼脂、卡拉胶等固化。2、半液半固体培养：固液双层。3、液体培养：震荡、旋转或静置培养。固体培养液体培养：体胚液体培养 根据培养材料分为：单细胞培养、原生质体培养、固定化细胞培养、小细胞团培养等。一 单细胞培养单细胞培养是从外植体、愈伤组织、细胞团中分离得到单细胞，然后在一定条件下进行培养的过程。通过单细胞培养可以观察细胞个体的分裂、生长和繁殖情况，可以获得细胞团，进而得到从单细胞形成的细胞系。从单细胞分裂、繁殖得到的细胞团和细胞系，可以认为具有相同的基因和特性。用这种细胞系迸行大规模细胞培养，得到较为均一的细胞及其代谢产物。（一）植物单细胞的获得1、从外植体直接分离单细胞外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经过一定孔径的不锈钢筛网过滤，得到细胞悬浮液。悬浮液中所含的完整细胞数量很少，分散性较好，可以看作是游离的单细胞悬浮液。2、从愈伤组织分离单细胞1）经过愈伤组织诱导获得脱分化愈伤组织的薄壁细胞团。2）将细胞团转移到液体培养基中，进行振荡培养，使细胞团分散成为单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去细胞团和残渣，得到单细胞悬浮液。3通过原生质体再生法获取单细胞1）外植体、愈伤组织或细胞团经过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞壁而获得原生质体。2）原生质体分离后，在一定条件下进行原生质体培养，使细胞壁再生，而获得单细胞悬浮液。（二）植物单细胞培养的方法由于植物细胞具有群体生长特性，单细胞往往难以生长、繁殖。为此，需要采用一些特殊技术1. 平板培养法概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养。由Bergman1960年首创的，其目的是为了获得单细胞系 ，并研究其生理生化和遗传上的规律。特点：-平板培养是选择优良单细胞株常用的方法。因为由平板培养所增殖的细胞团大多来自一个单细胞。-平板培养用的是1 mm厚的薄层固体培养基，在显微镜下可对细胞的分裂和细胞团的增殖进行追踪观察单细胞培养过程单细胞悬浮液的密度：一般为103个mL接种单细胞 将调整好细胞密度的单细胞悬浮液与50左右的固体培养基混合均匀，分装于无菌的培养皿中，水平放置，冷却，即为单细胞培养平板。培养 ：将上述单细胞培养平板置于培养箱中培养。 继代培养： 选取生长良好的由单细胞形成的细胞团，接种于新鲜的固体培养基上进行继代培养，获得由单细胞形成的细胞系。单细胞平板培养效率的检测所谓植板率即在平板上形成细胞团的百分率2看护培养概念：有些植物细胞，一旦单离出来，不仅不能分裂、增殖，还可能死亡。如果用一块愈伤组织（生长旺盛）来哺育单细胞，从而使其正常分裂、增殖的方法，称“看护培养” 特点：方法简便，但不能在显微镜下追踪细胞的分裂和细胞团的形成。 滤纸起渗透扩散养分作用；愈伤组织块可以促进单细胞的生长繁殖愈伤组织给单细胞传递了某些生物信息，或为单细胞的生长繁殖提供了某些物质条件例如植物激素等内源化合物。单细胞培养过程将生长活跃的愈伤组织块植人固体培养基的中间部位；愈伤组织接种几天后，在愈伤组织块的上方放置1片面积为1 cm2左右的无菌滤纸，取一小滴经过稀释的单细胞悬浮液接种于滤纸上方；置于培养箱中，在一定的温度和光照条件下培养若干天，单细胞在滤纸上进行持续的分裂和增殖，形成细胞团；将在滤纸上由单细胞形成的细胞团转移到新鲜的固体培养基中进行继代培养，获得由单细胞形成的细胞系3微室培养1）概念： 将接种有单细胞的少量培养基，置于微室中培养，使单细胞生长繁殖的培养方法。1955年，德若普（De Ropp）首次将接种有单细胞的一小滴液体培养基，在微室中进行单细胞悬浮培养。单细胞微室培养2）接种的细胞必须达到临界细胞密度以上。103个mL;密度过低，单细胞无法进行生长繁殖；密度过高，则形成的细胞团混杂在一起，难于获得单细胞形成的细胞系。3）培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动辐度大，培养细胞仅能短期分裂，因此，当细胞团长到一定大小，将其转移到另外培养基上。De Ropp1955年首先进行微室培养研究，进行单细胞活体连续观察。Jones1960年首先观察到烟草细胞分裂.4） 特点：微室培养所使用的培养基用量少，可以通过显微镜观察单个细胞的生长、分裂、分化、发育情况。有利于对细胞特性和单个细胞生长发育的全过程进行跟踪研究。三、单细胞培养的技术关键1.细胞的起始密度 -细胞密度：系指单位体积内的细胞数目，单位：103个mL -起始细胞密度：系指开始培养时，单位体积内的细胞数目。起始密度也就是最低有效密度。2.植物生长激素 生长素和分裂素是植物细胞培养中主要的 生长激素。 3温度:一般控制在25左右。4. pH: 一般控制在5.26.0的范围二 小细胞团培养 小细胞团是指由28个植物细胞聚合在一起而形成的细胞团块。小细胞团培养是将小团块接种于培养基中，在一定条件下进行培养的过程。（）植物小细胞团的形成1愈伤组织分割法愈伤组织分割法是在无菌条件下用镊子或者小刀将愈伤组织块分割成为小细胞团的过程。2单细胞增殖法1)植物细胞具有群体生长特性，2)细胞外围有一层果胶等胶体物质，容易将细胞粘在一起而形成细胞团。3) 单细胞培养过程中，单细胞经过分裂繁殖也形成细胞团。3细胞团分散法 细胞团分散法是通过机械搅拌或者通人无菌空气等，在剪切力的作用下，使大细胞团分散成为小细胞团的过程。（二）植物小细胞团的同步化方法细胞团大小不一样，所处的生长期有所不同，生长繁殖的能力和新陈代谢的水平也就有很大差别。为了使小细胞团在悬浮培养时处于比较均一的状态，需要进行同步化处理。1体积选择法体积选择法是根据细胞团的体积大小进行选择.将培养一段时间的细胞悬浮液，在无菌条件下，用一定孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞团，再用较小孔径的筛网过滤，获得颗粒大小较均匀的小细胞团，再悬浮于新鲜的液体培养基中进行培养。2低温处理法1) 将收集得到的细胞或小细胞团，在4左右的低温条件下处理13d，植物细胞在低温下全部停止生长繁殖，2)然后再悬浮于新鲜的液体培养基中，在25培养，于是细胞几乎同时开始生长繁殖，处于同步状态。3限制营养处理法1)将细胞或小细胞团悬浮在营养物质受到限制的培养液中培养几天，由于营养缺乏，细胞的生长繁殖受到限制，几乎所有的细胞都停止生长；2)然后再将细胞转移到新鲜的培养液中，进行悬浮培养，则细胞几乎同步地开始生长繁殖。4细胞分裂抑制法1)在细胞或小细胞团培养过程中，通过向培养液中添加某种细胞分裂抑制剂处理一段时间，所有的细胞都停止分裂；2)然后将细胞转移到新鲜的液体培养基中，在一定的条件下进行悬浮培养，则所有的细胞几乎同步地开始分裂。（三）植物小细胞团培养的方法植物细胞悬浮培养:植物细胞悬浮培养悬浮细胞培养是指将组织培养物分离成单细胞或小细胞团，悬浮在液体培养基上进行培养的方法。1、细胞悬浮培养的要求（1）细胞悬浮培养的材料要求为保持良好分散状态的单个细胞或小细胞聚集体。细胞悬浮培养的材料一般通过愈伤组织反复继代培养获得.选择疏松易碎的，外观新鲜湿润的愈伤组织继代培养，在培养的过程中不断进行搅拌和振荡,使愈伤组织上的细胞被剥落到培养液中，得到分散程度高的游离细胞悬浮物.（2）细胞接种：细胞合适的接种率为1:10(细胞:占培养基)。(3)细胞悬浮培养条件:悬浮培养通常采用水平振荡，速率为30-150r/min，或者通入气体搅拌。温度24-30为宜。pH值为5-7。(4)植物细胞都是好氧性的，因此需要连续不断地供氧。但是需氧量较低，最大氧摄入速率1-3.5 mmol/h，而微生物细胞是5-90 mmol/h.2、悬浮细胞的生长与增殖悬浮细胞扩增生长曲线为S型，经历延迟期，生长期和直线生长期，减慢期和静止期。图5-6悬浮培养细胞生长曲线悬浮培养细胞起始密度一般应在05-2.5105cellsmL，在培养过程中增加到1-4 106mL，每个细胞平均分裂4-6次，历经18-25d。3、细胞悬浮培养注意问题（1）防止细胞凝聚成块 植物细胞具有聚集在一起的特性，它们容易聚集成细胞团（2-200个细胞，直径2mm），或者细胞分裂后没有分离或分泌的粘多糖和蛋白质-细胞密度过大或粘性高引起混合和循环的不良。细胞增殖速度变慢，影响产物的质量和产量。(2)剪切力的影响植物细胞壁脆，对剪切力敏感。剪切力积极影响表现为增加通气,保持良好的混合状态和细胞分散性, 对细胞生长繁殖有利，提高细胞产率和次生代谢产物产量 多数情况下则呈现副作用,较高的搅拌速度会造成细胞损伤,引起胞内化合物的释放，影响细胞形态、代谢和产率及聚集状态等。 因此要选择合适的搅拌方式.（3）保持细胞培养无菌 植物细胞培养成分复杂而丰富，适合真菌生长， 植物细胞生长速度慢，生长周期长， 要2-3周或者2-3个月 极易造成污染。 所以在植物细胞培养系统的准备及培养操作中，保持无菌状态相当重要。4、 植物细胞培养反应器在放大中优化的条件中，两个最重要的物理因素是剪切、混合 。植物细胞对氧需求小，对剪切很敏感，不像微生物培养那样采用高剪切的搅拌。1）非机械搅拌（气体搅拌）生物反应器：特点：没有活动的机械搅拌装置，利用通入的空气运动带动培养液进行混合搅拌，对于长期操作保持无菌很重要。气体搅拌反应器设计得较高，因此搅拌更为有效。（1）鼓泡塔式反应器：