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质谱技术与方法 质谱分析法 massspectrometry MS 是将化合物形成离子和碎片离子 按质荷比 m z 的不同进行分离 来进行成分和结构分析的方法 所得结果用质谱图 亦称质谱 MassSpectrum 表示 根据质谱图提供的信息可以进行有机物及无机物的定性和定量分析 生物大分子的结构分析 样品中各种同位素比的测定及固体表面的结构和组成分析等 生物质谱 Bio massspectrometry Bio MS 是用于生物分子分析的质谱技术 生物质谱要求测定上万甚至是几十万的相对分子质量 随着电喷雾电离 ESI 和基质辅助激光解吸电离 MALDI 技术的完善和成熟 生物大分子的质谱分析才得以实现 TheNobelPrizeinChemistry2002 forthedevelopmentofmethodsforidentificationandstructureanalysesofbiologicalmacromolecules fortheirdevelopmentofsoftdesorptionionisationmethodsformassspectrometricanalysesofbiologicalmacromolecules forhisdevelopmentofnuclearmagneticresonance spectroscopyfordeterminingthethree dimensionalstructureofbiologicalmacromoleculesinsolution 约翰 芬 田中耕一 库尔特 伍斯里奇 质谱法的基本原理 质谱分析的基本过程是使样品在离子源中发生电离 生成不同质荷比的带电离子 经加速电场的作用形成离子束 进入质量分析器 在其中再利用电场和磁场使其发生色散 聚焦 获得质谱图 质谱分析中 多种离子化技术均可使物质分子失去外层价电子形成分子离子 molecularion M 分子离子中的化学键还可以继续发生某些有规律的断裂而形成不同质量的碎片离子 fragmention M M 碎片离子 中性分子 被分析样品离子电离后经加速进入磁场时 其动能与加速电压及电荷z有关 即 zeU 1 2 mv2 其中 z为电荷数 e为元电荷 e 1 60 10 19C U为加速电压 m为离子的质量 v为离子初加速后的运动速度 具有速度v的带电粒子进入质谱仪的质量分析器中 根据所选择的分离方式 最终各种离子按质荷比 m z 的不同实现分离 质谱仪 质谱仪包括进样系统 电离系统 质量分析器和检测系统 为了获得离子的良好分析 必须避免离子损失 因此凡有样品分子及离子存在和通过的地方 必须处于真空状态 在进行质谱分析时 一般过程是 通过合适的进样装置将样品引入并进行气化 气化后的样品引入到离子源进行电离 电离后的离子经过 适当的加速后进入质量分析器 按不同的m z 进行分离 然后到达检测器 产生不同的信号而进行分析 质量分析器 检测器 样品导入系统 离子源 真空泵 m z 计算机控制与数据处理 相对丰度 质谱仪的构成 Data SystemMassspectrumout InletSystem MassAnalyzer IonSource Detector Samplein Inletsystems Ionsources Massanalyzers Simplevacuumlock HPLC GC Electrospray ESI MALDI FAB LSIMS Electronionization EI Quadrupole Time of flight Iontrap Magneticsector FTMS MassSpectrometerSchematicVacuumenvelope 离子源 ionsource 质谱仪中将分子转化为离子的装置称为离子源 ionsource 由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大 因此 对于不同的分子应选择不同的离解方法 通常将能给样品较大能量 生成较多碎片离子的电离方法称为硬电离方法 如电子轰击离子化 EI 而给样品较小能量 碎片离子较少或不生成碎片离子的电离方法称为软电离方法 生物质谱中有代表性的离子源 1 电喷雾电离 ElectrosprayIonization ESI 2 离子喷雾电离 IonsprayIonization ISI 3 大气压化学电离 AtmosphericPressureChemicalIonization APCI 4 基质辅助激光解吸电离 MatrixAssistedLaserDesorptionIonization MALDI 5 快原子轰击电离 FastAtomBonbardmentIonization FAB 离子源是质谱仪的心脏 可以将离子源看作是离子化反应器 样品在其中发生一系列的特征裂解反应 反应在很短时间 10 11s 内发生 所以可以快速地获得质谱图 质量分析器 质量分析器是质谱仪的核心 它将离子源产生的离子按其质量和电荷比 质荷比m z m 离子的质量数 z 离子携带的电荷数 的不同 在空间的位置 时间的先后或轨道的稳定与否进行分离 以便得到按质荷比 m z 大小顺序排列而成的质谱图 质量分析器 massanalyzer 的种类 1 磁质量分析器 单聚焦质量分析器 双聚焦质量分析器 2 四极质量分析器 四极杆滤质器 3 飞行时间质量分析器 TOF 4 离子阱 IonTrap 质量分析器5 离子回旋共振质量分析器 其中 2 3 4是目前生物质谱分析中常用的质量分析器 检测器 1 直接电检测器2 电子倍增器3 闪烁检测器4 微通道板 计算机控制与数据处理系统 1 监控各单元的工作状态 实现质谱仪的全自动操作 2 数据的采集和简化 3 质量数的转换 4 扣除本底或相邻组分的干扰 5 谱峰强度归一化 6 标出高分辨质谱的元素组成 7 用总离子流对质谱峰强度进行修正 8 谱图的累加 平均 9 输出质量色谱图 10 单离子检测和多离子检测 11 谱图检索 质谱图 质谱分析中 按各离子m z的顺序及相对强度大小记录分析结果的图谱即为质谱图 由于图谱中离子的质量及相对强度是各物质所特有的 即反映了物质的性质和结构特点 因此通过质谱解析可以进行物质的成分和结构分析 常见的质谱图是经过计算机处理后得到的棒图 bargraph 常见的质谱图是经计算机处理的棒图 图中 纵坐标表示离子的相对丰度 以质谱中最强峰的高度为100 并将此峰称位基峰 其余峰按与 基峰的比例加以表示 又称为相对强度 横坐标表 示离子的质荷比 根据峰位 棒位 可进行定 性鉴别 根据相对丰度可 进行定量测定 15 28 29 31 基峰 32 分子离子峰 33 100 8060 40 20 10 20 30 40 50 m z 相对峰强 棒图 bargraph CH3OH Intensity 1239 4 1679 8 2120 2 2560 6 Mass m z 03001 0 0799 0 10 20 30 100 1480 60 1567 46908070605040 804 68 2044 21 1738 35 1570 45 1439 65 1894 262047 21 927 77 843 87 2470 78 2210 10 1923 27 1724 38 1000 70 1209 84 1391 67 1574 12 2661 872807 67 2066 13 牛血清蛋白 BSP 酶解产物的质谱图VoyagerSpec 1 BP 1480 6 8127 100 30 Int 100908070605040 3494 3495 3496 3497 3498 3499 3500 3501 3502 3503 3497 64223496 65413498 6256 3495 6545 3499 6528 203500 6595 3501 6502 Resolution 20 000 m z 胰岛素的高分辨质谱图 质谱仪的主要性能指标 衡量质谱仪整体性能的主要指标有 质量范围分辨率 质量准确度灵敏度 扫描速度等 不同类型质量分析器的性能指标 质量范围 massrange 是指质谱仪能够测量的离子质量范围 通常用最小和最大离子的离子质量表示 质谱分析中 是以核素12C质量 12C 12 000u 的1 12为一个质量单位 u 1u 12 00000g mol 1 6 02214 1023mol 1 12 1 66054 10 24g 在生物大分子的质谱分析中 还常用道尔顿 dalton Da 作为度量单位 1Da 1 6603 10 24g Da与u两者相差万分之三左右 在生物质谱分析中 可以视为1Da 1u 质量准确度 massaccuracy 质量准确度又称质量精度 即离子质量实测 值M与理论值M0的相对误差 质量精度 M M0 m 106 ppm m为离子质量数的整数 仪器的质量精度一般应小于10ppm 分辨率 resolution R 分辨率是指仪器能分离相邻两质谱峰的能力 若将强度近似相等 质量分别为M和M M的两个相邻峰恰好分开 则质谱仪的分辨率定义为 R m1 m2 m1 m1 M 其中m1 m2 为质量数 且m1 m2 故在两 峰质量相差越小时 要求仪器分辨率越大 重点介绍两种生物质谱分析方法 基质辅助激光解吸电离 飞行时间质谱 MatrixAssistedLaserDesorption Ionization TimeofFlightMassSpectra MALDI TOFMS 电喷雾电离 ElectrosprayIonization ESI 质谱 电喷雾离子化 ESI 原理 内衬弹性石英管的不锈钢毛细管 内径0 1 0 15mm 被加以2 5kV的正电压 与相距约1 2cm接地的反电极形成强静电场 被分析的样品溶液从毛细管流出时 在电场作用下形成高度荷电的雾状小液滴 在向质量分析器移动的过程中 液滴因溶剂的挥发逐渐缩小 其表面上的电荷不断增大 当电荷之间的排斥异力足以克服表面张力时 瑞利极限 液滴发生裂分 经过这样反复的溶剂挥发 液滴裂分过程 最后产生单个的气态离子 由于没有外界能量直接作用于分子 因此对分子结构破坏较少 是一种典型的 软电离 方式 ESI与MALDI的比较 质量分析器 massanalyzer 在生物质谱中 与ESI离子化源配合使用的质量分析器主要有 四极滤质器 离子阱分析器和离子回旋共振分析器等 随着技术的发展 也可以采用这些分析器的变型 四极滤质器 QuadrupoleMassFilter 四极滤质器也称四极质量分析器 它由四根截面呈双曲面的平行金属杆电极组成 离子束穿过对准四根杆之间空间的准直小孔 相对的一对电极是等电位的 两对电极之间的电位是相反的 离子源的电位比四极滤质器的电位略高几个伏特 以提供离子沿传播中心轴飞行所需的动能 离子阱 iontrap 质量分析器 离子阱质量分析器亦称四极离子阱 quadropoleiontrp 或Paul阱 简称离子阱 是一种通过电场或磁场将气相离子控制并贮存一段时间的装置 这种分析器是由双曲线表面的中心环形电极 ringelectrode 和上下各一个端盖电极 endcapelectrode 组成 中间形成一个空腔 阱 因此而成为离子阱 端盖电极接地 环形电极施以射频电压 离子阱内充有一定量的氦气 约10 3 Torr 这有利于离子朝中心聚集 而离子聚集得越紧凑 离子能量和位置分散越小 有利于提高分辨率和灵敏度 液相色谱 质谱联用技术 liquidchromatography massspectrometry LC MS LC MS把液相色谱技术强有力的分离能力与质谱技术有效的定性分析能力相结合 特别适合于复杂体系的分离分析 目前已成为蛋白质组学研究中最重要的技术平台之一 LC MS的开发在技术上十分困难 直到电喷雾电离 ESI 接口和大气压化学电离 APCI 接口出现 在20世纪90年代才有了成熟的商品化的液相色谱 质谱联用仪 HPLC 含有缓冲剂的水相 有机溶剂 非挥发性分析样品 Interface 脱溶剂 使分析样品发生离子化 MS 高真空度 按m z分析产生的离子 LC MS的基本构成 接口的作用就是将HPLC与MS两者实现在线的对接 它的主要作用是脱去来自HPLC的大量溶剂 使分析样品由液相转变为气相并发生离子化 接口性能的好坏在很大程度上决定着色谱 质谱联用仪器性能的优劣 好的HPLC条件可能是 坏的 MS条件 二者难以匹配 要实现HPLC与MS的有效的联用 必须解决以下困难问题 色谱仪与质谱仪的压力匹配问题色谱仪与质谱仪的流量匹配问题气化问题 谱图类型 色谱 质谱提供的信息 MS的谱图有 1 质谱图2 色谱图 3 全扫描色谱 质谱三维谱 谱图类型 色谱 质谱提供的信息 MS的谱图有 1 质谱图 质谱图是一次扫描时间内得到的峰强质荷比图 扫描方式又有连续扫描和跳变扫描之分 2 色谱图 3 全扫描色谱 质谱三维谱 色谱图 通常有三种类型 1 总离子流色谱图 TIC 2 质量色谱图 MC 3 选择离子监测图 SIM 一个例子 反相高效液相色谱 电喷雾电离质谱法测定人血浆 尿样中D L 异亮氨酸和D L 别异亮氨酸异构体 H2N COOH CHCH2CH H3C CH3 H2N COOH CHCH H2C CH3 CH3 Leucine Isoleucine 图 17对氨基酸和甘氨酸标准溶液衍生物的RP HPLC荧光检测色谱图 Fig ChromatogramsofOPTA AcCys derivativesof17pairsofstandardaminoacids andGly A L Ile B L allo Ile C D Ile D D allo Ile Conditions mobilephaseA 50mmol LNH4AC mobilephaseB methanol 0 10min mobilephaseB10 10 30min mobilephaseB10 40 lineargradient 30 70min mobilephaseB40 flowrate 0 2ml min columntempe