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白藜芦醇对高脂血症大鼠血小板聚集的影响及其机制研究白云霞杭州市第一人民医院，浙江杭州 310004中图分类号：R363.2 文献标识码：A摘要：目的 研究白藜芦醇对高脂血症大鼠血小板聚集的影响及其可能机制。方法 建立大鼠的高脂血症模型，同时连续ig 给予白藜芦醇（50mg/kgd）或空白溶媒30d，测定大鼠血浆总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、丙二醛、超氧化物歧化酶，一氧化氮、内皮一氧化氮合酶、P-选择蛋白，血栓烷B2、和6-酮-前列腺素F1，ADP诱导的血小板5分钟最大聚集率。结果 与饲高脂饲料组比较，饲高脂血症大鼠在连续ig给予白藜芦醇（50mg/kgd）30 d后，大鼠血浆TG、TC、LDL-C含量平均下降，分别下降19%,31%,51%，HDL-C含量平均增加1.33倍；超氧化物歧化酶和内皮一氧化氮合酶活力升高，一氧化氮和6-酮-前列腺素F1含量增加，丙二醛、P-选择蛋白、血栓烷B2含量降低，ADP诱导的血小板5分钟最大聚集率降低。结论 白藜芦醇能有效降低血小板聚集，可能是通过降低血脂水平，防止脂质过氧化和保护内皮细胞完整，影响一氧化氮合成，维持血浆或组织中的TXA2和PGI2平衡及细胞内外的钙离子平衡等多环节来发挥作用。关键词：白藜芦醇； 高脂血症；血小板聚集 Study of the effects and the mechanismof resveratrol on platelet aggregation in hyperlipidemia rats Bai Yun-Xia, (Hang zhou first hospital, Hangzhou 310000)Abstract: Aim To explore the effects and the mechanism of resveratrol on platelet aggregation in hyperlipidemia rats. Methods Experimental hyperlipidemia rats were ig administration of resveratrol (50mg/kgd) or vehicle in 30 d. The levels of plasma triplyceride (TG), total cholesterol (TC), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD)，nitric oxide (NO), endothelial nitric oxide synthase (eNOS), granulemembrane protein-140（GMP-140），thromboxaneB2 (TXB2)，6-keto prostaglandin F1 (6-keto-PGF1) and platelet maximal aggregation rate（MAR）which was induced by ADP in 5 minute were measured. Results Plasma TG, TC,LDL-C and HDL-C of the rats fed high fat diet (HFD) and ig resveratrol (50mg/kgd) was 19%， 31%，51% lower and1.33times higher than that of the HFD group rats. The activity of SOD and eNOS in resveratrol and HFD group was higher (P0.01) and The content of NO and 6-keto-PGF1 in resveratrol and HFD group was higher (P0.01) and the MDA、 GMP-140、TXB2 and MAR in resveratrol and HFD group was lower than that of the HFD group (P0.05). Conclusion Platelet aggregation rate was descreased in experimental hyperlipidemia rats by i.g. administration of resveratrol. its mechanism closely correlates with decline of plasma lipid and anti- peroxide of lipid and protecting vasoendothelial cells and improving the synthesis of NO as well as Keeping the balance of TXA2and PGI2 in tissue or plasma and the balance between extracellular calcium and intracellular calcium. Key words: resveratrol; Hyperlipidemia; platelet maximal aggregation rate作者简介：白云霞，女，主管药师，研究方向：药理学，电话 e-mail：. 高脂血症常伴有血小板活化，而血小板活化又是高脂血症向动脉粥样硬化发展的重要危险因素。流行病学调查发现，与其他发达国家生活方式相同的法国，冠心病的发病率、死亡率相当低，这一现象称为“法国悖论”(French paradox)。大量研究结果提示“法国悖论”与红酒的摄食相关,而且还明确红酒中的最有效成分是白藜芦醇(3，4，5三羟基二苯乙烯，resresveratrol，Resv)，白藜芦醇是植物界分布较广的一种多酚类化合物，因其在白藜芦的根部中首次发现而得名，已知白藜芦醇存在于70多种种子植物中，如常见的药用植物决明、黎芦、虎杖和食物葡萄、红酒、花生等。目前已证实白藜芦醇具有抗肿瘤、抗氧化、抗心血管疾病、抗血小板聚集、调节免疫、化学预防及雌激素样作用等作用1。其中抑制高脂血症大鼠血小板聚集也多有报道，但对其抑制机制的研究较少2，本实验我们观察白藜芦醇对高脂血症大鼠血小板分泌、释放、聚集功能的影响，以探讨其可能机制，有利于深入了解白藜芦醇抑制血小板聚集和抗心血管疾病的作用。1 材料和方法1.1 试剂和仪器 白藜芦醇购买于中美华东制药有限公司(98%, HPLC),实验时用二甲基亚枫(DMSO)溶解后蒸馏水配制为所需的浓度,其中DMSO质量分数不超过2%。总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）（购自德赛诊断系统（上海）有限公司）采用日立7020全自动生化分析仪测定（Japan）。丙二醛（malondialdehyde ,MDA）、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、一氧化氮（nitric oxide ，NO）、内皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase ，eNOS）测定试剂盒，（南京建成生物工程研究所）；血浆P-选择蛋白( granulemembrane protein-140 ，GMP-140)，血栓烷B2 (Thromboxane B2 ，TXB2 )、和6-酮-前列腺素F1(6-keto-prostaglandin F1，6-Keto -PGF1) 放射免疫试剂盒（苏州大学血液研究所），采用GC2911-放射免疫计数器（中国科学技术大学科技实业总公司）测定；ADP诱导的血小板5分钟最大聚集率（platelet maximal aggregation rate，MAR）（购自北京世帝科学仪器公司）采用LG-PABER-1血小板聚集凝血因子分析仪测定。1.2 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠96只，平均体重250300 g，由中科院上海实验动物中心提供。平衡饮食1周后随机分组，正常对照组：饲正常饲料（糖、蛋白质及脂肪各占总热量的62%、1及21%），并ig给予2%二甲基亚枫溶液（4ml/kgd）。高脂饲料模型组：饲高脂饲料（high fat diet, HFD）; 由普通基础饲料配置而成，含10%猪油， 2%胆固醇，0.2%胆盐，并ig给予2%二甲基亚枫溶液（4ml/kgd）。高脂饲料白藜芦醇组：饲高脂饲料，并ig给予白藜芦醇 （50mg/kg d）。常规饮水，连续给药30 d。1.3 样本采集 实验前晚禁食不禁水。大鼠乙醚麻醉后，心脏取血，制备血浆，-20保存备用。1.4 血脂测定 全自动生化分析仪测定血浆TG、TC、LDL-C及HDL-C。1.5 氧化及抗氧化指标测定 丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力按试剂盒说明测定。MDA及SODx测定批内变异系数（n = 5）分别为2.2%及2.5%, 批间变异系数(n = 3)分别为2.8%及3.7%。1.6 一氧化氮（NO）、内皮一氧化氮合酶（eNOS）按试剂盒说明测定。NO及eNOS 测定批内变异系数（n = 5）分别为0.7%及1.2%, 批间变异系数(n = 3)分别为1.5%及1.7%。1.7 P-选择蛋白(GMP-140) 、血栓烷B2 (TXB2 )和6-酮-前列腺素F1（6-Keto -PGF1）按试剂盒说明测定。GMP-140 、TXB2及6-Keto -PGF1测定批内变异系数（n = 5）分别为1.8%、2.6%及2.3%, 批间变异系数(n = 3)分别为3.2%、2.8%及3.5%。1.8 血小板聚集测定 血小板5分钟最大聚集率（platelet maximal aggregation rate，MAR）用LG-PABER-1血小板聚集凝血因子分析仪测定。MAR测定批内变异系数（n = 5）为2.1%，批间变异系数(n = 5)为3.1%。1.9 统计学处理 实验数据均以x s表示。双侧t检验进行组间显著性分析，P 0.05认为差异有显著性。2.结果2.1 白藜芦醇对高脂血症大鼠血浆TC、TG、HDL-C及LDL-C含量的影响 与饲正常饲料大鼠相比，在连续饲高脂饲料30 d后，大鼠血浆TG、 TC及LDL-C含量均升高（TG，1.98倍；TC，1.74倍；LDL-C，2.36倍），而HDL-C含量下降（HDL-C下降13%），这表明本实验中高脂血症大鼠模型建立成功。与高脂饲料模型组大鼠相比，高脂饲料白藜芦醇组大鼠血浆TG含量平均下降19%，TC含量平均下降31%，LDL-C含量平均下降51%，HDL-C含量平均增加1.33倍（P 0.01），结果详见表1。表1. 白藜芦醇对高脂血症大鼠血浆TC、TG、HDL-C及LDL-C含量的影响(x s, n = 10 ) 组别TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL-C (mmol/L)LDL-C (mmol/L)正常对照组高脂饲料模型组高脂饲料白藜芦醇组0.530.141.050.06c0.850.03f 1.550.202.690.21c1.830.34f3.280.262. 860.28 c3.790.24 f2.640.296.240.48 c3.080.23 f与正常对照组比较c P 0.01 ；与高脂饲料模型组比较f P 0.012.2 白藜芦醇对高脂血症大鼠血浆SOD活力及MDA含量的影响 与对照组相比，高脂饲料组大鼠血浆SOD活力较对照组显著性降低（P 0.01），MDA含量显著性增加（P 0.01）。饲高脂饲料大鼠在连续ig给予白藜芦醇（50mg /kg）30d后，大鼠血浆SOD活力均较高脂饲料模型组显著增加（P0.01），MDA含量降低（P0.05），结果详见表2。表2 白藜芦醇对高脂血症大鼠血浆SOD及MDA含量的影响(x s, n = 10 ) 组别SOD (U/mL)MDA (nmol/ml)正常对照组高脂饲料模型组高脂饲料白藜芦醇组155.722.6788.182.72c159.886.96f4.181.516.431.49c4.921.01e与正常对照组比较c P 0.01 ；与高脂饲料模型组比较e P 0.05，f P 0.012.3 白藜芦醇对高脂血症大鼠血浆eNOS活力及NO含量的影响与对照组相比，高脂饲料组大鼠血浆eNOS活力及NO含量较对照组显著性降低（P 0.01）。高脂饲料加白藜芦醇组大鼠血浆eNOS活力及NO含量均较高脂饲料模型组显著增加（P0.01），结果详见表3。表3 白藜芦醇对高脂血症大鼠血浆eNOS活力及NO含量的影响组别eNOS (U/mL)NO (mol/ L)正常对照组高脂饲料模型组高脂饲料白藜芦醇组46.074.5636.176.23 c45.317.28 f38.745.3431.545.40 c36.345.14 f与正常对照组比较c P 0.01 ；与高脂饲料模型组比较f P 0.012.4 白藜芦醇对高脂血症大鼠血浆 TXB2 和6-Keto-PGF1含量的影响与对照组相比，高脂饲料组大鼠血浆TXB2 含量明显升高,（P 0.01），6-Keto-PGF1含量明显下降（P 0.01）。饲高脂饲料大鼠在连续ig给予白藜芦醇（50mg /kg）30 d后，大鼠血浆TXB2均较高脂饲料模型组血浆中TXB2 含量明显降低,有非常显著差异( P 0. 01)，血浆6-Keto-PGF1含量明显升高, 差异具有显著性( P 0. 01) 。结果详见表4。表4白藜芦醇对高脂血症大鼠血浆 TXB2 和6-Keto-PGF1含量的影响组别TXB2 (pg/ml)6-Keto-PGF1(pg/ml)正常对照组高脂饲料模型组高脂饲料白藜芦醇组962 731433 112c927 50 f512 89276 28 c453 71 f与正常对照组比较c P 0.01 ；与高脂饲料模型组比较f P 0.012.5 白藜芦醇对高脂血症大鼠血浆GMP-140及血小板聚集的影响 与对照组相比，高脂饲料组大鼠血浆GMP-140含量及MAR显著性增加（P 0.01）。饲高脂饲料大鼠在连续ig给予白藜芦醇（50mg /kg）30 d后，大鼠血浆GMP-140含量及MAR降低（P0.01）。说明白藜芦醇具有抑制高脂血症大鼠血小板聚集及GMP-140释放的作用，结果详见表5。表5.白藜芦醇对高脂血症大鼠GMP-140含量及MAR的影响组别GMP-140 (g/L)MAR (pg/ml)正常对照组高脂饲料模型组高脂饲料白藜芦醇组28.7810.4954.8710.91 c35.6710.68 f0.210.080.520.11c0.380.13 f与正常对照组比较c P 0.01 ；与高脂饲料模型组比较f P 0.012 讨论本实验中，高脂血症大鼠饲白藜芦醇后，大鼠血浆TC及 LDL-C含量均下降，而HDL-C含量却增加，这与已有的研究结果基本一致，而白藜芦醇影响血脂代谢的主要途径可能主要通过促进胆固醇转化为胆酸来实现的 3 髙脂状态下，自由基生成增加，自由基作为体内的主要氧化因子，能引起机体发生多种组织器官损伤，如动脉粥样硬化。本次实验中，髙脂模型组的抗氧化指标SOD活力明显下降，而脂质氧化产物MDA含量显著增加，也证明了脂质发生了氧化。而白藜芦醇组能增加SOD活力，降低MDA含量，使其基本达到正常对照组水平。已有研究表明白藜芦醇中含大量具有很强的自由基清除能力的多酚物质，是其抗氧化能力的物质基础4。高血糖和高血脂可使内皮细胞的线粒体产生过多的过氧化物，这些过氧化物可减少eNOS 的表达并使NO 清除速度加快、生物学作用减低 5。我们的研究中显示高脂饲料组大鼠血浆eNOS活力及NO含量较对照组显著性降低，但白藜芦醇可使高脂血症大鼠血浆eNOS活力及NO含量均增加。这可能是由于白藜芦醇能维护血管内膜及内皮细胞的完整性，而这些被保护的血管内皮细胞可通过eNOS 催化L- 精氨酸生成NO，使高脂血症大鼠eNOS活力 和NO含量升高，NO发挥血管舒张及其他多种生物学效应，如减轻氧化应激6。在正常生理状态下,血浆或组织中的TXA2和PGI2处于相对平衡,保持机体内环境的稳定。因TXA2和PGI2的生物半衰期极短,目前难以直接测定,但可通过测定其稳定的代谢产物TXB2 和6-Keto-PGF1来反映其含量。高脂状态下，这种稳定的内环境被打破，表现两个指标的变化。在本次试验研究中发现，高脂血症大鼠血浆TXB2均较正常对照组升高,6-Keto-PGF1含量降低，这可能是由于在髙脂状态下，高浓度LDL-C、TC、TG以及发生了氧化修饰脂蛋白使血管壁受损而内皮脱落时，局部PGI2丧失，内膜cAMP减少，暴露的胶原组织刺激血小板7，首先经PG代谢合成TXA2，而TXA2促使致密管系统的Ca+游离， 细胞内形成钙流, 使胞内钙离子浓度显著上升。而细胞内外的钙离子对于血小板的激活起着重要的调控作用。钙离子作为活化信息的传递者, 通过活化PLC和PLA2 作用于磷脂, 产生TXA2 或PAF 等血小板活化的重要介质, 使血小板变形、分泌、释放血小板颗粒膜蛋白-140（GMP-140）、TXB2、血小板4因子（PF4）、血小板球蛋白（-TG）以及外膜表面改变, 并发生聚集反应 8,9 。白藜芦醇作为一种天然植物提取物，其抗肿瘤、抗氧化、抗心血管疾病、抗血小板聚集、调节免疫等作用在国内外已有很多报道。本次研究的其抗血小板聚集的作用也与报道一致, 高脂血症大鼠给予白藜芦醇之后,其血浆TXB2 和GMP-140含量明显降低, 6-Keto-PGF1含量明显升高，血小板聚集显著降低。其原因是白藜芦醇除有降脂及抗氧化能力外，保护血管内皮，促进一氧化氮生成，维持血浆或组织中的TXA2和PGI2平衡及细胞内外的钙离子平衡，降低血小板活化、分泌、释放相关介质，从而达到抑制血小板聚集聚集的目的6-9。参考文献1 Pervaiz S, Holme AL. resveratrol: its biologic targets and functional activityJ. Antioxid Redox Signal, 2009, 11(11):2851-2897.2 杨雨民，王世君，王宏强。等白摹芦醇体外抗血小板作用及机制初探，中国药学杂志，2009；44(3)：191194.3 .Pellegrini N, Simonetti P.Composition of platelet phospholipids aftemorderate consumption of resveratrol in healthy volunteersJ .Eur J CliNutr. 1996,50(8):5355414 Natella F,Ghiselli A,Guidi A,Ursini F,Scaccini C. resveratrol mitigates the postprandial increase of LDL susceptibility to oxidation. Free Radical Biology&Medicine,2001,30(9):1036-1044.5 Nascimento NR, Lessa LM, Kerntopf MR, et al. Inositols prevent and reverse endothelial dysfunction in diabetic rat and rabbit vasculature metabolically and by scavenging superoxide. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103: 218- 223.6 Wallemth T。Li HGodtelAmbrust U，d et a1A blend of poly