生物技术药物学期末复习.doc

生物技术药物期末复习总结题型：看英文写全称，名解，填空，问答1、生物技术药物就是利用生物工程技术制造的药物，它和传统的化学药物以及从动、植物中提取药物的最大区别在于生产过程。国家药品监督管理局将其列入新生物制品药物(以DNA重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞因子类药物，及用蛋白质工程技术制造的上述产品及其修饰物)。反义药物、基因药物和核酶也属于生物技术药物的发展领域。2、受体(receptor)：是一类介导细胞信号转导的功能蛋白质，是一些能与生物活性分子如神经递质,激素,药物等相互作用的分子.3、新药（New Drugs）新药系指未曾在中国境内上市销售的药品。对已上市药品改变剂型、改变给药途径、增加新适应症的药品注册按照新药申请的程序申报，但改变剂型但不改变给药途径，以及增加新适应症的注册申请获得批准后不发给新药证书（靶向制剂、缓释、控释制剂等特殊剂型除外）。定义包含以下三种类型：1.我国未上市，国外也未上市的创新药物2.我国未上市销售生产，国外也未销售但已有文献报道过的药物；3.国外已上市销售的，但未在国内销售过对已上市药品改变剂型但不改变给药途径的注册申请，应当采用新技术以提高药品的质量和安全性，且与原剂型比较有明显的临床应用优势。改变剂型但不改变给药途径，以及增加新适应症的注册申请，应当由具备生产条件的企业提出。 改变剂型但不改变给药途径，以及增加新适应症的注册申请获得批准后不发给新药证书 。4、竞争性拮抗剂：（competitive antagonists) 药物与受体有较强的亲和力，但缺乏内在活性，本身不能引起效应，但能占据一定量的受体，拮抗作用是可逆的。非竞争性拮抗药：不与激动剂争夺同一位点，其与受体的结合可引起构型改变，妨碍激动剂与受体的结合，或使激动剂与受体结合后不产生生物效应。其结合相对不可逆，能改变激动剂的量效曲线，使量效曲线抑制，斜率降低。在任何浓度下都可阻止激动剂在特定受体产生最大效应，使激动剂的量-效曲线向右移，但斜率及最大效应均降低，因此增加激动剂浓度不能解除非竞争性拮抗剂的拮抗作用。5、先导化合物：从众多天然来源或化学合成的候选化合物中发现具有进一步研究开发意义的物质，具有特定生理活性的化合物,可作为进行结构修饰和改造的模型,从而获得预期药理作用的药物称为先导化合物，是新药研究的起始和基础。6、高通量药物筛选(high throughput screening,HTS)是近年发展起来的新药筛选新方法,主要由自动化操作系统、高灵敏度检测系统、分子细胞水平的高特异性体外筛选模型及被筛样品管理库(即样品库)的建立、数据采集传输处理系统等5个主要部分组成,使实验过程程序化,有合理、科学的管理系统。由于这些筛选方法是在微量条件下进行,同时采用自动化操作系统,可以实现大规模的筛选,因而称为高通量药物筛选。高通量药物筛选采用的筛选方法一般是以药物作用靶点为主要对象的细胞和分子水平的筛选模型,根据样品与靶点结合的表现,判断化合物的生物活性。在传统的筛选技术基础上,应用先进的分子生物学、细胞生物学、计算机、自动化控制等高新技术,建立的一套更适合于药物筛选的技术体系。7、药品注册是指国家食品药品监督管理局根据药品注册申请人的申请，依照法定程序，对拟上市销售的药品的安全性、有效性、质量可控性等进行系统评价，并决定是否同意其申请的审批过程。8、药代动力学研究指ADME，absorption,distribution,metabolism,excretion；包括药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄。主要研究新药在体内的吸收速率、吸收程度，在体内各重要器官的分布和维持情况以及排泄的速率和程度等。9、耐受性，抗药性，依赖性一些药物在指定剂量时，其反应强度在治疗过程中可能会发生改变，随着连续给药，反应性通常降低，产生对药物作用的耐受性病原微生物对抗微生物药物产生的耐受性称抗药性（resistance）麻醉药品或精神药品连续使用时还可产生药物依赖性（drug dependence）10、合理药物设计(Rational Drug Design) 是以某一疾病发生的分子机制为基础，进一步确定药物作用的靶物质，并尽可能阐明靶分子的结构与功能，再以靶分子为对象设计药物分子，使其能专一结合于靶分子的活性部位(如酶的活性中心)，从而能改变靶分子的活性以发挥药物分子的治疗作用。常见的靶物质有以下几种：.酶：.受体：3.离子通道，4.核酸11、组合化学：采用化学、生物学或生物合成方法，把诸如核苷酸、氨基酸、单糖以及各种小分子，系统地装配成不同的组合，高效自动化合成结构多样性，具有多种特征的大量分子，建立可供筛选的化学物质库。12、治疗指数，安全指数，激动剂与部分激动剂治疗指数（TI） 用LD50/ED50表示。此数值越大越安全。 安全指数 用LD5/ED95表示。完全激动剂（full agonist)有很高的亲和力和内在活性 ，与受体结合时能产生最大药理效应。部分激动剂(partial agonist)对受体有一定的亲和力，也受体结合产生较弱效应。由于亲和力较小，即使浓度再增加也不可能达到最大效应。13、干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。干扰素是细胞因子家族中最早被发现的。根据分子结构和抗原性的差异分为、等多个类型。型干扰素又可分为1b 2a 2b等亚型。干扰素具有蛋白质的性质并含有一个家族的不同蛋白质,并且在核酸序列和三维空间结构上都有结构相关性。其生物学活性还有免疫调节和调节多种类型细胞的生长和分泌，及维持某些动物细胞早期的胚胎发育。干扰素命名：已发现六大类干扰素，第一类称为干扰素，主要是由白细胞产生，由166个氨基酸；第二类称干扰素，主要是由结缔组织中成纤维细胞产生，也由166个氨基酸组成；第三类称干扰素，主要是由T淋巴细胞产生，由143个氨基酸组成。第四类、第五类,第六类分别称为干扰素、干扰素， 。14、模仿创新创新药物有原始创新药物和模仿创新药物。原始创新是提供具有新作用机制、新分子结构类型的发明；模仿创新也称快速跟踪创新或“me too”创新，是在不侵犯他人专利权的基础上，对已知药物的药理、毒理、代谢及临床效果、作用机理、构效关系等进行充分研究，然后以该药为先导化合物进行结构修饰或改造，得到的改进的化学实体。模仿创新（me-too）的研究方法：密切注视新出现的，很成功的突破性新药，包括“me-too” 途径研制的新药，对母体药物进行结构修饰和改造，寻找新的化学实体对某些无专利保护的新药，尽快进行结构改造形成自己的知识产权保护。有专利保护的新药，深入研究其专利保护范围，在不侵犯专利情况下进行专利边缘创新。有意识的改变局部化学结构，有可能获得强于母体的新药。重视手性药物的开发。如对已有的外消旋体药物进行研究开发成单一对映15、转基因动物是指通过基因工程的手段对动物基因组的结构或组成进行人为的修饰，并通过相应的动物育种技术使这些经修饰改造后的基因组在世代间得以稳定的传递和表达。动物基因组中稳定地整合含有外源性基因的动物。可以大容量、廉价地生产复杂蛋白16、细胞因子(Cytokine,CK)：主要是由免疫细胞分泌的、在体内含量极低、具有多种生物学活性的小分子多肽、蛋白质或糖蛋白的统称。17、三股螺旋DNA技术脱氧寡核苷酸能与双股螺旋双链DNA特异性序列结合,形成三股螺旋DNA,这种三螺旋结构可阻止转录RNA和DNA的复制,因其作用原理有别于RNA的反义技术,所以有人将三螺旋DNA技术称为反基因技术.其配对原则是:人工合成15-40个碱基的脱氧核苷酸,使其按T.AT,C+.GC,G.GC,A.AT三碱基体与双链DNA结合,通常结合在蛋白质识别位点处,形成三链DNA.三股螺旋DNA的优点:三股螺旋DNA所需剂量较反义RNA小得多，这是因为它的作用靶点在转录水平的DNA序列上 ,而反义RNA是作用于经转录后放大的mRNA水平.三股螺旋DNA特异性高,发生个别碱基错配的机率低.存在问题:半衰期短,稳定性不够,在整合生物具有形成三股螺旋的同聚嘌呤和同聚嘧啶DNA片段较少.18、生物等效性生物等效性试验:是指用生物利用度研究的方法，以药代动力学参数为指标，比较同一种药物的相同或者不同剂型的制剂，在相同的试验条件下，其活性成份吸收程度和速度有无统计学差异的人体试验。 19、白细胞白细胞又叫白血球或白血细胞，可以分为三种亚家族，单核巨噬细胞，淋巴细胞和粒细胞20、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）是一类能直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子。根据其来源和结构的不同分为TNF-和TNF-两种类型。TNF-主要是由巨噬细胞产生，LPS是其较强的诱导剂，T细胞和NK细胞在某些刺激因子（如PMA）作用下也可分泌此类因子。TNF-主要是由活化的T细胞产生，T细胞在抗原、丝裂原等刺激物的作用下可合成高水平的TNF-。TNF-在最初发现时称为淋巴毒素（lymphotoxin,LT），是淋巴细胞杀伤抗原性靶细胞的效应因子。21、生物药物利用生物体、生物组织或器官等成分，综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的一大类药物。分为生化药物,生物技术药物,生物制品.22、生物制品国家药品监督管理局将生物制品定义为“生物制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、酶工程、发酵工程等生物技术获得的微生物细胞及各种动物和人源的组织和液体生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品”,将通过生物技术加工制造的产品均归为生物制品。一般意义上是指用微生物、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等加工制成的预防、治疗和诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂。主要指菌苗、疫苗、毒素及血液制品等23、集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF) 指能刺激多能造血干细胞和不同发育分化阶段的造血干细胞进行增殖分化，并在半固体培养基中形成相应集落的细胞因子；最初研究造血干细胞是从软琼脂的半固体培养基开始的，在这种培养基中，造血干细胞分化增殖产生的大量子代细胞由于不能扩散而形成细胞簇，称之为集落，而一些刺激造血干细胞的细胞因子可明显刺激这些集落的数量和大小因而命名为集落刺激因子（CSF）。根据它们刺激的造血细胞种类不同有不同的命名，如GM-CSF、G-CSF、M-CSF、multi-CSF(IL-3)等。24、多中心试验是由多位研究者按同一试验方案在不同地点和单位同时进行的临床试验。各中心同期开始与结束试验。多中心试验由一位主要研究者总负责，并作为临床试验各中心间的协调研究者。多中心试验应当根据参加试验的中心数目和试验的要求，以及对试验用药品的了解程度建立管理系统，协调研究者负责整个试验的实施25、JAK-STAT通路JAK（just another kinase或janus kinase）是一类蛋白酪氨酸激酶家族，在调节多种细胞因子调节蛋白的信号传导因子方面起核心作用。因为含有两个活性位点，因此被称为Janus。已发现四个成员，即JAK1 、JAK2 、JAK3 和TYK2。其氨基酸序列有40%的同源性。 JAK的底物为STAT，即信号转导子和转录激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT），目前已有6种STAT得到确认。STAT被JAK磷酸化后发生二聚化，然后穿过核膜进入核内调节相关基因的表达，这条信号通路称为JAK-STAT途径 。配体与受体的结合促进受体的二聚化，使与受体连接的JAKs相互靠近，并发生磷酸化，活化的JAKs进一步使受体的特定酪氨酸发生磷酸化而促进一种或多种胞浆蛋白STATs家族成员与受体连接并发生磷酸化激活。活化的STATs转运到细胞核，直接对干扰素和其它细胞因子的基因表达进行调控。26、IFN营养胚素，最先发现于反刍动物体内。功能：维持怀孕早期的黄体功能，与妊娠有关。与 HCG相似，有抗病毒能力。结构：成熟的IFN蛋白由172个氨基酸组成，与I型受体相互作用。属I型干扰素，在体外，能与 ，受体结合。生物学活性：能产生与I型干扰素类似的效果，包括抗病毒和免疫调节。但是毒性降低，同时它能加强HIV病毒感染细胞对逆转录酶活性的抑制。重组的绵羊蛋白IFN已报道对治疗多发性硬化症和AIDS病毒感染有效。人的IFN没有绵羊蛋白的潜在免疫原性，具有治疗价值，但至今尚未发现这样人的基因。问答题1、 药物的跨膜信号传导跨膜信号转导有四种机制：A脂溶性药物可以通过细胞膜，作用于胞内受体。 B配体与跨膜受体结合，使胞内酶产生变构活性调节。 C通过配体-门控跨膜离子通道进行信号转导。 D通过G-蛋白偶联的受体进行信号转导2、生物技术药物的主要品种类型，未来10年的研究方向生物技术药物的主要品种类型（1） 细胞因子干扰素类（2） 细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子（3） 造血系统生长因子类（4） 生长因子类（5） 重组蛋白质与多肽类激素（6） 心血管病治疗剂与酶制剂（7） 重组疫苗与单抗制品（8） 基因药物未来10年的生物技术药物（） 肿瘤（） 神经退化性疾病（） 自身免疫性疾病 （） 心脑血管疾病 （） 病毒感染性疾病（） 基因治疗和转基因技术 3、新药的一般研究开发过程化合物发现基本特性研究临床前研究申报临床人体试验临床试验（期）申报试生产申报生产证书产品投放市场后市场跟踪分析通常在进入临床试验之初同时申请专利4、生物新药研究中哪些研究成果可申请发明专利（可以申请专利的生物药物研究成果）从专利保护角度出发，生物技术发明一般分为三类：（1）方法发明。即利用生物转化、纯化、和分离等技术手段产生活的有机体或其他生物组分的方法发明。如一种纯的微生物培养方法，B12的发酵生产法（2）用途发明。也称生物特性利用发明。指有关动物、植物、微生物或其他生物组分的生物特性在应用或用途方面的发明。对于基因和DNA序列的专利主要是保护具有功能的基因和它们的克隆产物的应用(如EPO、tPA)。（3）产品发明。指动植物或其他生物组分的发明。如一种纯的微生物培养物，分离的病毒，专一纯化的蛋白。纯化的核酸序列(包括分离的功能基因、质粒等)，以及其他纯化的生物分子(如抗生素、维生素)等。如果是采用基因重组、体细胞杂交等现代生物技术得到的产品，均是人工创造而非自然界存在的，因此符合发明定义。如果是用选育、突变、筛选等传统方法，需分析用该方法得到的产品是发现还是发明，是否为技术成果。5、生物技术药物临床前毒性评估有哪些特殊之处？有些生物技术新药会引起免疫应答反应，应进行进一步研究，然而，最常见的一些生物技术动药物如细胞因子其首选功能就是调节免疫活性。因此有关免疫毒性试验应有选择性进行。 生物技术药物的临床前毒性评估有些试验项目较难判定，如人源性重组产品，以动物进行过敏试验、显然不尽合理，这些困难的主要原因有：(1)生物技术药物的种族特异性，如GH和某些细胞因子，他们在人体引起的生物活性在试验动物身上并不反映。干扰素具有高度种属特异性，人源性干扰素对人体的药理活性远远超过对动物的活性 人源性蛋白质的组成和氨基酸序列与其它种系的同种蛋白质也不相同，因此重组人源性产品在其它宿主中往往会产生免疫应答，改变生物学效应，并可能因形成免疫复合物而导致毒性反应，这种毒副反应与人体安全性显然无关。(2)生物技术药物与化学药物比较，各个批量产品之间有较大不同。(3)在长期毒性研究中，可能引起免疫应答。(4)在某些情况下，尚缺少合适的有效分析方法。 对rDNA产品的临床前安全性试验要求，难于一概而论，应采取较为灵活的处置方法。除了按一般生物制品的毒性试验要求外，其它如长期毒性试验，药代动力学试验、药理学试验、毒理学试验，以及致畸和致突变等试验，应根据制品性质，与国家药品监督机构及药品审评中心商定后按样本性质拟定所需进行的试验项目和方法，以及评定标准。6、药物临床试验分期以及各分期的主要目的一、期临床试验:初步的临床药理学及人体安全性评价阶段目的：研究人体对新药的耐受程度和药代动力学，为制订给药方案提供依据。2受试者：在国家药监局新药审评办指定的定点临床试验医院 ， 遵循临床试验规范（GCP），选择10-30例的志愿者，受试者有知情权，男女各半，应给受试者必要的报酬。3给药剂量：一般不超过预测剂量的十分之一作为人用的起始剂量，并应事先确定耐受性试验的最大剂量，一般以临床应用该药单次最大剂量为限。从起始剂量至最大剂量之间用几个剂量级别，需视药物安全范围大小根据需要而定。在达到最大剂量仍无毒副反应一般即可终止试验。切不可机械地按动物剂量折算为人用剂量。二、期临床试验为治疗作用初步评价阶段，可分为两阶段进行，初步评介药物对目标适应症患者的治疗作用和安全性 (一)第一阶段1.目的；在有对照组的条件下详细考察新药的疗效、适应症和不良反应。2.试验设计；在国家药监局，新药审评办指定的临床试验医院进行，设置对照组，要随机分组，用随机双盲对照法进行试验。对照药：已知有效药物对照组（阳性）和安慰剂对照组（阴性对照）。3.剂量；药物的使用剂量根据期临床试验结果而定，一般采用一种固定剂量。(二)第二阶段1、目的：在较大范围内对新药作全面评价，要求进一步扩大病例数（不少于300例）和扩大临床试验单位（不少于3个，多中心实验），可以不采用双盲法。三、期临床试验治疗作用确证阶段，扩大的多中心临床试验。其目的是进一步验证药物对目标适应症患者的治疗作用和安全性，评价利益与风险关系，最终为药物注册申请获得批准提供充分的依据。试验一般应为具有足够样本量的随机盲法对照试验。该期的病例数更大，一般为1000-3000。 又称为后市场试验，(Post marketing trials)， 其目的就是评价药物长期使用的安全性，疗效和不良反应，尤其对于长期使用的药物。7、GCP包括哪些内容(1) 确认临床试验单位及研究人员的资格和职责(2) 对试验的医疗机构的技术、设备条件和参加试验的研究人员具体要求。(3) 对受试者的安全性保护执行(4) 试验用药品管理(5) 研究单位与临床单位之间协议书的内容与要求(6) 对试验方案的具体要求(7) 有关临床试验设计的内容与要求(8) 有关试验程序的详细规定(9) 数据处理与统计分析的要求(10) 临床试验记录与保存的要求(11) 确保GCP实施的有关监督与管理规定8、简述生物技术药物一般生产过程生物技术药物的生产可分为上游和下游两个阶段。上游阶段是指构建稳定高效表达的工程细胞(或工程菌)，主要包括目的基因的分离，工程菌的构建与筛选；下游阶段是指工程菌的大规模培养，一直到产品的分离纯化、制剂、质量控制等一系列工艺过程。生物技术药物制造过程的主要程序是：获得目的基因构建DNA重组体将重组体导入宿主细胞鉴定筛选阳性克隆构建基因工程菌（或工程细胞）培养工程菌分离纯化表达产物除菌过滤半成品检定制剂成品检定包装 9、药品质量管理规范文件有哪些，英文缩写分别是什么？研究与开发者，临床前研究，GLP(good laboratory practice 药品非临床研究质量规范)临床研究单位，GCP(Good clinical practice 药品临床试验管理规范)药品生产企业 ，GMP(Good Manyfacturing practice 药品生产质量管理规范)使药品经销商，GSP(Good supplying practice 医药商品质量管理规范)医院，消费者，GUP(Good use practice 医药商品使用管理规范)中药栽培企业，GAP（Good Agriculrure Practice 中草药栽培规范）医院药房和药剂科，GPP（Good Pharmacy Practice 医院药房质量管理规范）10、如何获得纯化水和注射用水纯化水：为原水经离子交换法、反渗透法、蒸馏法或其他适宜方法制得的供药用的水，不含任何附加剂，可作为配制普通药物制剂用的溶剂或试验用水，不能于注射剂的配制。注射用水：为纯化水经蒸馏所得的水，应符合细菌内毒素实验要求，可作配制注射剂用的溶剂。11、蛋白质类药物的物理和化学不稳定作用，如何保持和提高生物技术药物的稳定性？蛋白质类药物因其分子具有严格的三维结构，所以其生物活性不仅取决于其分子的一级结构，还与其空间结构的完整性密切相关。 有两个主要因素影响它们的稳定性：化学上的不稳定性，由多种因素引起的对蛋白质分子的化学基团进行化学修饰，引起原有化学键的断裂或形成新的价键形式。主要有：氧化作用，脱酰胺作用，水解作用，外消旋作用，-消去反应等。物理的不稳定性。主要是涉及到更高级空间结构的改变，包括蛋白质分子二级或高级空间结构的改变，这些改变的引起因素如：温度，pH 等蛋白质类药物的物理性或化学性的降解可能发生在多种不同环节，包括制造生产过程、纯化操作过程、处方制剂及贮存流通使用过程。一、生物技术药物的化学稳定性（重点）氨基酸的侧链不稳定性：Asn，Asp，Cys，Gln，His，Lys，Met，Phe，Ser，Thr，Trp和Tyr等残基的侧链常易发生各种化学反应，含不稳定侧链的氨基酸残基常常可通过非酶促反应，使共价键断裂或对分子进行共价修饰。 （1）水解作用在酸、碱、酶的催化下可发生肽键的水解与脱酰氨基作用，产生多肽片段、氨基酸或氨基酸残基等； 一般酸、碱、蛋白酶的水解-X-Asp-Y，含有Asp残基，在稀酸中更易水解水解作用也常发生在蛋白质的酰胺键，Asn,Gln。N末端临近Pro和Ser和Thr也易发生水解。蛋白质水解后发生的质量和大小变化可用HPLC，HPCE(高效毛细管电泳技术)，SEC（尺寸排阻层析）进行分析，用SDS-PAGE及MS分析不同的水解片段。（2）氧化作用主要原因有两种：一是氧化剂的污染。如在H2O2、多种过氧酸，N-氯代或溴代琥珀酰胺，过碘酸，碘等氧化剂的作用下；二是自身的自发氧化。 Met 、Cys 、His、Trp、Tyr等最易氧化。含有Met和Cys残基的侧链极易发生氧化反应。含有芳香族侧链的氨基酸残基如His、Trp、Tyr残基的蛋白质类药物在纯化与贮藏过程中也易发生氧化反应，导致芳香环的破裂。三、 蛋白质的氧化作用还受到微量过渡金属离子的催化，光照也可增加其氧化作用 。氧分压，温度和缓冲液也对氧化作用有影响。发生氧化作用后的产品疏水性增加或极性增强，可用RP-HPLC分析，氧化产品比天然产品先洗脱下来。还可通 HPCE，SEC（尺寸排阻层析），SDS-PAGE分析。（3）脱酰胺作用 只有两种氨基酸Asn和Gln其侧链含有酰胺键，因此只有含这两种氨基酸残基的蛋白质才会发生脱酰胺作用。Asn和Gln可以水解生成羧酸和氨，同时转变为Asp和Glu，此反应取决于环境的pH。提高pH、温度和离子强度都可能增加脱酰胺作用。Asn-Gly具有最高脱酰胺速率 ，位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。脱酰胺后蛋白质疏水性及极性发生变化，质量减少电荷增加，因此可分别用反相，质谱或NMR进行分析（4）消旋作用 消旋作用是在一个以上的不对称中心发生的构型改变。蛋白质的外消族作用是其L-氨基酸残基转化为D-氨基酸残基，这种构型的改变，并不改变蛋白质的整体骨架结构，但其分子的局部构型已发生改变，整个分子的构象也已改变，使侧链与侧链的相互作用发生变化。消旋作用的发生取决于碱催化-碳质子离子化成为负碳离子中间体，进而使氨基酸由L型转为D型。除甘氨酸外，碱催化消旋反应对任何氨基酸均可发生，使生成具D型与L型混旋构型的蛋白质 。其本质是 甲基氢被氢氧根离子除去，形成负碳离子中间体，进而使L型转向D型。消旋作用后蛋白质形成了对映体与非对映体，根据旋光的变化可以区别它们。（5）二硫键的错配形成二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键，导致结构改变和活性丧失。另外含二硫键结构的多肽或蛋白质通过还原剂的作用会使二硫键断裂，致使蛋白质类药物失去活性，常用还原剂如-巯基乙醇，DTT等。错配后的蛋白质疏水性增加，用反相-HPLC分析，还原后保留时间延长。也可用还原和非还原SDS-PAGE进行分析。（6）-消去反应 -消除是指氨基酸残基中碳原子上基团的消除。含Cys,Ser,Thr,Phe,Lys残基的蛋白质在碱性条件下易发生-消去反应，此反应进程与消旋作用一样也要经过负碳离子中间体进程，在金属离子存在下有催化作用，反应受到pH、温度等多种因素的影响 。发生-消去的产品易发生聚集、吸附、沉淀。可利用光吸收的变化来进行分析。二、生物技术药物的物理稳定性（简单了解）1、变性作用在某些物理、化学的条件下，蛋白质分子的高级结构受到破坏（但一级结构未被破坏），结果引起蛋白质生物活性的损失和理化性能的改变，这就是蛋白质的变性。凡能影响蛋白质分子二、三、四级结构稳定性的因素均可导致蛋白质变性，如温度（加热）、pH、光照、超声波处理、高频振荡、表面活性剂、有机溶剂和变性剂等。变性作用有可逆的，也有不可逆的，变性蛋白质降低了水溶性，改变了三维结构，增加了对蛋白酶的水解敏感性，导致了天然蛋白生物活性的降低与丧失。2、表面吸附（电荷 和水层）表面吸附作用对某些蛋白质具有强力破坏作用，如胰岛素会在玻璃表面、塑料容器和试管壁上沉淀出来，也会在静注塑料袋内表面和输液泵内表面沉淀出来。如rIL-2在进行曲灌注时会吸附在管道表面，造成活性损失。非离子型表面活性剂如“TWeens” 表面活性剂也用于稳定蛋白质溶液，可以防止蛋白质在物体表面的吸附作用，这可能是通过与蛋白质分子周围的水分子相互作用。3、共价自身凝聚在多肽变性过程中，蛋白质的折叠与去折叠首先形成中间体。通常中间体的溶解度低，易于聚集，形成可溶性和不溶性聚集体，进而形成肉眼可见的沉淀。聚集体减少了蛋白质活性，改变了免疫原性。疏水相互作用是形成聚集体的主要驱动力。发生聚集作用的蛋白质主要发生大小的变化和沉淀形成。提高生物技术药物稳定性的途径 1、定点突变 通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，可提高多肽的稳定性。2、化学修饰 多肽的化学修饰方法很多，研究最多的是PEG修饰。PEG是一种水溶性高分子化合物，在体内可降解，无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可体质或提高原生物活性。3、添加剂 通过加入添加剂，如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类，可以提高多肽的稳定性。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中，上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象，而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。此外表面活性剂如SDS、Tween，能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。4、冻干 多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、-消除、水解等都需要水参与，水还可以作为其它反应剂的流动相。另外，水含量降低可使多肽的变性温度升高。因此，冻干可提高多肽的稳定性。12、生物技术药物表达系统大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞的表达方式和特点大肠杆菌A.表达方式细胞内不溶性表达：包含体胞内可溶性表达：分离纯化较困难细胞周质表达：用渗透振扰法分离产物,可避免细胞内蛋白酶的降解，胞外分泌型表达：通过信号肽携带等操作，是最优选的方法。B.特点分泌能力不足，真核蛋白在E.coli中常形成不溶性包含体，表达产物必须变性和复性处理才能使目的蛋白恢复生物活性。在E.coli表达体系中不存在翻译后修饰作用，对蛋白质产物不能进行糖基化，因此只能用于表达不需糖基化作用的真核蛋白。由于翻译常从起始密码子AUG(甲硫氨酸)开始，因此目的蛋白的N末端常多了一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌还会产生内毒素，故目的产品应作内毒素检测 产生蛋白酶会破坏目的蛋白酵母A特点：酵母易繁殖，可以大规模廉价培养，而且没有毒性，能将表达产物分泌到细胞外，表达产物能糖基化，在细菌中难于表达的真核基因在酵母中可获得高效表达。它有以下特点：是真核表达体系，对表达蛋白可进行折叠和翻译后修饰与糖基化；表达量高培养基成本低；适用高密度发酵；杂蛋白少，产物易纯化。 B缺点色素难以除去 啤酒酵母表达量偏低；大量表达时，常会有质粒丢失；重组蛋白发生超糖基化；分泌蛋白留在壁膜间隙，增加了纯化难度。毕赤酵母表达系统优于啤酒酵母哺乳动物细胞 A优点：哺乳动物细胞可将表达产物由重组转化细胞分泌到培养液中，使产物易于纯化。哺乳动物细胞分泌的表达产物是糖基化的，接近或类似天然产物。可获得结构与天然蛋白相一致的活性蛋白，对于制造结构复杂的生物药物是其它系统所无法比拟的。B缺点：细胞生长缓慢、生产效率低、培养条件苛刻、费用高，培养液中产物浓度稀，因此生产成本高，扩大生产规模有较大困难。常用的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵细胞(CHO细胞)和幼仓鼠肾细胞(BHK)13、生物技术药物终产品质量控制从哪几个方面进行控制基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求:产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。产品的鉴别纯度分析生物学活性测定稳定性考查产品一致性的保证14、细胞因子生物学活性（一）特点(1)绝大多数细胞因子为分子量小于25kDa的糖蛋白，分子量低者如IL-8仅8kDa。多数细胞因子以单体形式存在，少数细胞因子如IL-5、IL-12、M-CSF和TGF-等以双体形式发挥生物学作用。大多数编码细胞因子的基因为单拷贝基因(IFN-除外)，并由45个外显子和34个内含子组成。(2)主要与调节机体的免疫应答、造血功能和炎症反应有关。(3)以自分泌、内分泌、旁分泌的形式发挥作用。通常以旁分泌或自分泌 形式作用于附近细胞或细胞因子产生细胞本身。在生理状态下，绝大多数细胞因子只在产生的局部起作用。(4)高效能作用，体内含量极低，一般在pM(10M)水平即有明显的生物学作用。(5)多种细胞可产生一种细胞因子，一种IL可由许多种不同的细胞在不同条件下产生， 如IL-1除单核细胞、巨噬细胞或巨噬细胞系产生外，B细胞、NK细胞、成纤维细胞、内皮细胞、 表皮细胞等在某些条件下均可合成和分泌IL-1。(6) 一种类型的细胞可以产生多种细胞因子 (7)多重的调节作用(multiple regulatory action)， 细胞因子不同的调节作用与其本身浓度、作用靶细胞的类型以及同时存在的其它细胞因子种类有关。有时动物种属不一，相同的细胞因子的生物学作用可有较大的差异，如人IL-5主要作用于嗜酸性粒细胞，而鼠IL-5还可作用于B细胞。（多效性）(8)重叠的免疫调节作用 (overlapping regulatory action)，如IL-2、IL-4、IL-9 和IL-12都能维持和促进T淋巴细胞的增殖。（重叠性）(9)以网络形式发挥作用，细胞因子的网络作用主要是通过以下三种方式:a 一种细胞因子诱导或抑制另一种细胞因子的产生，如IL-1和TGF-分别促进或抑制T细胞IL-2的产生；b: 调节同种或不同种细胞因子受体的表达，如高剂量IL-2可诱导NK细胞表达高亲和力IL-2受体；IL-1、IL-5、IL-6等可促进IL-2受体的表达；IL-1能降低TNF受体的密度; :细胞因子生物活性之间的相互影响 B细胞和T细胞活化过程中，常需要两种以上细胞因子的协同作用或彼此调节（网络性）一种细胞因子可对多种靶细胞发挥作用，产生多种不同的生物学效应，称多效性；几种不同的细胞因子也可同一种靶细胞发生作用，产生相同或相似的生物学效应，称重叠性；一种细胞因子可以抑制另一种细胞因子的某些生物学作用，表现为拮抗效应；可以增强另一细胞因子的某些生物学作用表现为协同效应。（二）细胞因子的主要功能细胞因子具有非常广泛的功能，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。 1、免疫细胞的调节剂2、免疫效应分子3、造血细胞刺激剂4、炎症反应的促进剂5、诱导凋亡 6、其它。多细胞因子除参与免疫系统的调节效应功能外，还参与非免疫系统的一些功能。例如IL-8具有促进新生血管形成的作用；M-CSF可降低血胆固醇;IL-1刺激破骨细胞、软骨细胞的生长；IL-6促进肝细胞产生急性期蛋白等。这些作用为免疫系统与其它系统之间的相互调节提供了新的证据.15、干扰素的产生细胞及临床应用IFN：白细胞产生;第一个运用于临床研究的重组干扰素是干扰素-2a。干扰素-2a和干扰素2b已批准用于毛细胞白血病的治疗。IFN：成纤维细胞产生；多发性硬化症IFN：活化的T淋巴细胞产生；慢性肉芽瘤，类风湿性关节炎16、干扰素的结构改造1、融合干扰素在所有IFN-亚型的序列和活性都弄清后,设计融合体改进天然亚型的活性,或制造融合体根本改变IFN的性质。融合分子的结构功能分析表明IFN- 分子的N末端部分对它们的生物活性至关重要。将IFN- 1的前61个氨基酸残基与2的后104个氨基酸残基组成的融合体对鼠细胞表现出高度抗病毒活性。IFN- 1的前91个氨基酸残基与4的后72个氨基酸残基组成的融合体没有抗病毒活性，但却提高了抗肿瘤活性。IFN-con1是一种合成的非天然的融合体I型IFN，由人IFN- 家族中最常出现的氨基酸组合设计而成。其166个氨基酸序列是通过扫描若干天然IFN- 亚型的序列，将各个相应位置最常出现的氨基酸组合设计而成。其分子大部分是2与 1的融合体，额外改变了4个氨基酸序列以促进分子构建。20个氨基酸不同于2（88%同源性），与b有34%的同源性。其生物活性要比其他IFN 高5-20倍。其治疗丙型肝炎的临床试验表明：用相等的抗病毒单位比较时，疗效与2a 和2b相似。但等重量比较，其在抗病毒、抗增殖、NK细胞激活能力和干扰素诱导基因上调活性等方面都有很大提高。其高活性源于它与受体有更强的亲和力。2、PEG化干扰素PEG交联分子有更高的耐热性，物理稳定性，更好的抗蛋白酶降解的保护性，更好的溶解性，更长的体内循环半衰期和更低的清除率，降低免疫原性和抗原性。IFN- 的半衰期是4-8h，注射24h后血清中极少或无法测得。为了维持有效浓度要每日注射。早期研究5kD的PEG与IFN- 2a连接，但II期临床证明其疗效比 IFN- 2a差而中止。将 IFN- 2b与PEG（12kD）共价交联，形成31kD分子，可以每周给药一次。最近研发出的PEG（40kD）-IFN 2a ，PEG（20kD）-IFN 2b药理学性质都得到预期改善。17、干扰素抗病毒机制IFN抗病毒作用是通过影响两个酶系统而实现的，一是激活蛋白激酶产生磷酸化，使起起动因子“翻译”过程障碍，病毒复制受阻；二是激活25-寡腺苷酸合成酶，激活内源性核酸内切酶,分解病毒mRNA，终致病毒复制受阻。 IF-2蛋白激酶干扰素能够诱导细胞产生蛋白激酶eIF-2, 最初合成的eIF-2蛋白激酶不具备催化活性，遇到dsRNA才被激活。激活的eIF-2蛋白激酶使底物eIF-2磷酸化eIF-2是真核细胞转录起始因子（ eukaryocyte initiation factor 2, eIF-2）的亚基（eIF-2），进一步阻断小核糖体亚单位的合成，病毒复制不能启动，最后阻止所有病毒（和细胞）mRNA的翻译活动.2-5AS（ 2-5寡腺苷酸合成酶）在和敏感细胞膜上的受体作用下,细胞合成大量无活性的2- 5,当有双链核糖核酸(,为各种病毒复制过程中的一种中间产物)存在时,新合成的2- 5被激活,它以为底物,催化合成一系列热稳定的、以2,5磷酸二酯键相连接的寡聚腺苷酸片段即2 -5,其片段长度不等,在214之间;所生成的2- 5又可作为一种激活剂激活细胞内存在的通常处于非活性状态的F，L。活化的F，L则可以降解病毒的和细胞的,从而抑制蛋白质的合成。 18、IL-2结构与功能关系，如何合理改造？IL-2结构与功能关系（1）螺旋A与结合 IL-2受体链有关。其中Asp20和Leu17高度保守，用Lys取代后可使IL-2完全失去活性和结合能力。（2）螺旋A和螺旋B-B中的Lys35、Arg38、Phe42或Lys43与IL-2结合 IL-2受体链的有关。用Ala代替Arg38后， IL-2则不能与 IL-2受体链结合。（3）螺旋D中的Gln126与 IL-2结合链有关。（4）Leu17、 Phe44和 Trp121是 IL-2的活性位点。（5）除去IL-2 N端1-10AA，活性下降30-50%。除去IL-2 N端1-20AA，活性消失。（6）Cys58,Cys105,Cys125 Cys58-Cys105 形成二硫键，在保持IL-生物学活性上起关键作用。Cys125易使IL-2形成链间二硫键，形成二聚体，使IL-2活性下降。在IL-2基因产物的提纯和复性过程中，如二硫键配错或分子间形成二硫键都会降低IL-2的活性。 改变 IL-2的氨基酸序列或分子结构，均会影响其活性效应。IL-2的改造（1）定点突变针对结构中Cys125易形成链间二硫键进行定点诱变（site-spcific mutation），降低了包涵体复性过程中的二硫键错配的可能性，有效防止分子内二硫键的错配或分子间二聚体的形成。现已有应用点突变，将第125号位半胱氨酸突变为亮氨酸或丝氨基，使其只能形成一种二硫键，保证了在IL-2复性过程的活性。还有报道用蛋白工程技术生产新型rIL-2，将IL-2分子第125位半胱氨酸改为丙氨酸，改构后IL-2比活性比天然IL-2明显增加。 （2）.PEG修饰的IL-2IL-2水溶性差,生物活性不稳定,分子量小且血浆半衰期短,体内作用时间短，半衰期只有6.9分钟,需长时间大剂量持续静脉滴注，不仅费用大而且易出现严重的毒副作用,故限制了rIL-2系列免疫疗法的疗效及扩大应用。 。用PEG对IL-2加以修饰，PEG-IL-2 分子量为25KD，生物活性保留70%， PEG成分具有部分协同IL-2促进LAK效应， PEG-IL-2激活LAK细胞和对肝癌细胞的杀伤力接近甚至强于IL-2，半衰期可延长7倍左右。 （3）IL-2融合蛋白（DAB389 IL-2）皮肤细胞淋巴瘤是以淋巴细胞异常增殖并侵犯皮肤为主要表现的一组疾病, 大约60%CTCL患者的肿瘤上存在IL-2受体，仅这种病人用此药治疗才有效。IL-2是激活T淋巴细胞增殖的主要细胞因子。 DAB389IL- 2是IL-2特异靶融合蛋白,由大肠埃希杆菌重组融合基因产生,该融合基因包括白喉毒素A片段、跨膜蛋白B片段和人IL-2。该融合蛋白含有IL-2R结合部位及白喉毒素的细胞毒部分,能够与含有IL-2R的细胞结合,通过细胞内吞作用进入细胞，不可逆的抑制蛋白质合成,导致靶T细胞死亡。(4)长效白介素改善IL-2作用时间和效果的方法也是研究的热点，如白细胞介素2长循环脂质体。19、IL-11生物学活性，临床应用协同IL- 3等促进巨核细胞的形成和成熟,促血小板生成。抑制脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase,LPL)活性和脂肪细胞的分化，抑制脂肪形成,故又称脂肪形成抑制因子(AGIF)临床应用：血少板减少症20、TNF结构与功能关系，副作用，如何根据TNF结构与功能关系进行改造以降低副作用，如何合理用药以提高药效？（1）具有生物活性的hTNF其空间结构是3个TNF单体以边对面形式形成的近似三角锥形的三聚体,结构与功能研究表明,去端前7个氨基酸残基不影响hTNF三聚体空间结构。去端7个氨基酸残基的同时增加端的碱性氨基酸,可以增强形成活性三聚体的能力,从而提高hTNF的抗肿瘤活性。端的氨基酸具有高度的同源性,对该区域进行缺失改造会引起hTNF的生物学活性明显下降。由于端位于三聚体的内部,3个单体157位的氨基酸相互靠得很近,这种空间结构的维持主要依赖于氢键和疏水性相互作用,因此增加端的疏水性氨基酸可以提高hTNF的抗瘤活性。（2）TNF临床应用常见毒副反应全身用药TNF的副作用一般表现为寒战、发热、流感样症状、生化指标异常，低血压、毛细血管渗漏综合征以及中枢神经等系统的症状。 (1)心血管系统:低血压、心律失常;(2)血液系统:中性粒细胞、血小板、淋巴细胞、白细胞、血红蛋白减少,停药后恢复;(3)神经系统:头痛、发热、疲倦、感觉异常、肌痛、定向障碍、癫痫样发作、行为异常;(4)肝损伤:胆红素、转氨酶、碱性磷酸酶升高,停药后恢复;(5)消化系统:恶心、呕吐、腹泻、消化不良、胃出血;(6)肾脏损伤:尿少、肌酐清除率下降;(7)肺脏损伤:可出现致命的急性呼吸困难综合症ARDS症状、过敏样支气管痉挛;(8)皮肤系统:注射点痛、硬结、红肿、瘙痒、过敏反应、脱发;(9)代谢系统:体重下降、甘油三酯升高。局部用药当局部TNF 外漏至全身血管大于1%时,会出现低血压、呼吸稍抑制,但一般不会出现ARDS,大部分病人出现高热、血小板减少、肝肾轻度损伤等。所有这些反应称为全身炎症反应,停药后可完全恢复。（3）TNF结构改造TNF结构改造（N端改造）（1）删去端7肽,且将hTNF的Pro8 Ser9 Asp10用Arg8 Lys9 Arg10替代