（植物学专业论文）拟南芥rack1和agb1蛋白的纯化及其相互作用研究.pdf

王连连 拟南芥r a c k l 和a g b l 蛋白的纯化及其相互作用研究 拟南芥r a c k l 和a g b1 蛋白的纯化及其相互 作用研究 捅要 蛋白质问的相互作用存在于机体的各个细胞生命活动过程 基因的复制 转 录 蛋白质的翻译 剪切 分泌以及细胞周期的调控 信号转导 物质代谢等生 命过程均受到蛋白质问相互作用的调控 蛋白质间相互作用的顺利进行是细胞正 常生命活动的保障 因此 研究蛋白质问的相互作用具有十分重要的意义 r a c k l r e c e p t o rf o ra c t i v a t e dc k i n a s e1 r a c k l 被认为是一种支架蛋白 在细胞信号转导中具有重要的作用 异三聚体g t p 结合蛋白 h e t e r o t r i m e r i cg t p b i n d i n gp r o t e i n g 蛋白 是活细胞内一类具有重要生理调节功能的蛋白质 r a c k l 和a g b1 蛋白都属于w d 4 0 蛋白家族 两者具有相似的结构 r a c k l 和g b 参与了植 物许多生理 生化及对环境胁迫的响应过程 在动物中r a c k l 和g b 间存在相互作 用 那么 植物r a c k l 和g b 间是否也像哺乳动物细胞中的情况一样存在相互作用 阐明这一科学问题对深入了解植物r a c k l 和g b 的调节机制具有重要的科学意义 本实验首先利用大肠杆菌表达系统成功将编码拟南芥r a c k l 和a g b l 蛋白的 基因克隆到表达载体上 通过i p t g 诱导分别使拟南芥r a c k l 和a g b l 蛋白得到 了有效表达 为进一步获得拟南芥r a c k l 和a g b l 蛋白抗体奠定基础 在此基础 上 还用g s tp u l ld o w n 和酵母双杂交技术验证了拟南芥r a c k l 和a g b l 蛋白不 存在相互作用 研究结果表明 1 将编码拟南芥r a c k l 蛋白的基因克隆到质粒p g e x 一6 p 一1 上 构建表达 质粒p g e x 一6 p 一1 a t r a c k l 表达量占菌体总蛋白的3 2 通过表达条件的优化 采用0 1 m mi p t g 浓度 2 4 为最佳表达条件 s d s p a g e 电泳分析其可溶性 结 果表明约5 0 的融合蛋白可溶 选择上清依次过谷胱甘肽 琼脂糖树脂亲和层析柱 和s e p h a d e x g 1 0 0 凝胶柱纯化 纯度达9 5 2 将编码拟南芥g 蛋白6 亚基的基因克隆到质粒p e t 3 2 a 上 构建表达质 粒p e t 3 2 a a g b l 表达量占菌体总蛋白的3 5 通过表达条件的优化 采用0 1 r a m i p t g 浓度 2 4 为最佳表达条件 s d s p a g e 电泳分析其可溶性 结果表明融合 蛋白全部以包涵体形式存在 将含有表达质粒p e t 3 2 a m g b l 的菌体蛋白进行超声 波破碎 离心后得到包涵体沉淀 分别用t r i t o nx 一1o o 和1 m 的尿素洗涤包涵体 包涵体蛋白经8 m 尿素变性后 采用分步透析法使变性蛋白复性 将复性后得到的 i i 扬州大学硕士学位论文 蛋白进行柱层析分离纯化 纯度达8 8 3 在本实验的表达系统中 a t r a c k l 蛋白收率为9 m g l 发酵液 a g b l 蛋白收率为2 1m g l 发酵液 4 应用离体 g s tp u l ld o w n 和活体 酵母双杂交技术 蛋白相互作用技 术分析了拟南芥r a c k l 和g 蛋白b 亚基 a g b l 间的相互作用 结果表明 两 者之间不存在相互作用 关键词 拟南芥 r a c k l a g b1 g s tp u l ld o w n 酵母双杂交 王连连 拟南芥r a c k 和a g b i 蛋白的纯化及其相互作用研究 p u r i f i c a t i o no fr a c k1a n dg p r o t e i nps u b u n i tf r o m a r a b i d o p s i sa n d t h e i rp o s s i b l ei n t e r a c t i o n a b s t r a c t p r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o n sp l a y sk e yr o l ei nt h er e g u l a t i o no fm a n yc e l l u l a r p r o c e s s e s s u c ha sg e n er e p l i c a t i o n t r a n s c r i p t i o n p r o t e i nt r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o na n d s e c r e t i o n i ta l s o r e g u l a t e s t h ec e l l c y c l ep r o c e s s s i g n a lt r a n s d u c t i o na n d m e t a b o l i z a t i o n t h e r e f o r e i d e n t i f i c a t i o no fp r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o n si sc r u c i a lf o r u n d e r s t a n d i n gc e l l u l a rf u n c t i o n s r e c e p t o rf o ra c t i v a t e dck i n a s e1 r a c k1 i sav e r s a t i l es c a f f o l dp r o t e i nw h i c h p l a y sc r i t i c a lr o l e si nm u l t i p l ed e v e l o p m e n t a lp r o c e s s e s h e t e r o t r i m e r i cg t p b i n d i n g p r o t e i ni s ak i n do fp r o t e i nw i t hi m p o r t a n tp h y s i 0 1 0 9 i c a l l yr e g u l a t o r yf u n c t i o n si n l i v i n gc e l l s r a c k la n dgp r o t e i nps u b u n i t g b p r o t e i na l lb e l o n gt ow d 一4 0r e p e a t p r o t e i n s al o to fp r e v i o u sr e s u l t ss h o w e dt h a t i nm a m m a lc e l l s r a c k li n t e r a c t sw i t h g 8 r a c k la n dgp r o t e i n sh a v ea l s ob e e ni d e n t i f i e di nh i g h e rp l a n t sa n da r ep r o p o s e d t op l a yr e g u l a t o r yr o l e si np h y s i o l o g i c a l b i o c h e m i c a lp r o c e s s e sa n di nt h er e s p o n s e st o e n v i r o n m e n t a ls t r e s se t c h o w e v e r w es t i l lk n o w1 i t t l ew h e t h e rr a c k li n t e r a c t sw i t h g p a g b1 i np l a n t sl i k et h ec a s ei nm a m m a l s i n t h i ss t u d y w ef i r s t l yu s et h eb l 21 e x p r e s s i o ns y s t e mt oe x p r e s sa r a b i d o p s i s r a c k la n da g b 1 a n ds c r e e nt h eo p t i m a le x p r e s s i o nc o n d i t i o n s r e s p e c t i v e l y a n d t h e n w eu s eb o t hi nv i t r o g s tp u l l d o w n a n di nv i v o y e a s tt w oh y b r i d t e c h n i q u et o s t u d yt h ep o s s i b l ei n t e r a c t i o nb e t w e e nr a c k la n da g b1 t h eg e n e se n c o d i n gr a c k la n da g b lf r o ma r a b i d o p s i sg e n o m ew e r ec l o n e di n t o p l a s m i d sp g e x 一6 p 一1a n dp e t 3 2 a r e s p e c t i v e l ya n dc o n s t r u c t e dt h ee x p r e s s i o np l a s m i d p g e x 一6 p 一1 a t r a c k l a n dp e t 3 2 a a g b l t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fi p t g a n i n d u c e ro ft h er e c o m b i n a n tp l a s m i d si s0 1 m mf o rb o t ht h ee x p r e s s i o np l a s m i d s t h e o p t i m a le x p r e s s i n gt e m p e r a t u r ei s2 4 c t h er e s u l t sa l s os h o w e dt h a tt h em a x i m a l e x p r e s s i o na m o u n ti nt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d s i sa b o u t32 a n d35 o ft o t a l e x p r e s s e dp r o t e i nf o rr a c k 1a n da g b 1 r e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r e a b o u t50 r a c k1p r o t e i ni se x p r e s s e di nt h es o l u b l ef r a c t i o n w h e r e a st h ea g b1i se x p r e s s e di n t h ei n c l u s i o n b o d y t h r o u g has e r i e so fp u r i f i c a t i o np r o c e d u r e s i n c l u d i n gd i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o n a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h ya n ds d s p a g e t h ep u r i t yo fr a c k la n d a g b1a r e9 5 a n d8 8 r e s p e c t i v e l y 扬州大学硕士学位论文 t h e r ei sn oi n t e r a c t i o nb e t w e e na t r a c k la n da g b1i d e n t i f i e db yg s tp u l l d o w na n dy e a s t t w o h y b r i d k e yw o r d s a r a b i d o p s i st h a l i a n a r a c k1 a g b1 g s tp u l ld o w n y e a s t t w o h y b r i d 王连连 拟南芥r a c k l 和a g b l 蛋白的纯化及其相互作用研究 缩略语英文全称 符号说明 a b b r e v i a t i o n s 中文名称 a b aa b s c i s i ca c i d a g b 1 a r a b i d o p s i sgp r o t e i nps u b u n i t b p b a s ep a i r d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d n t p d e o x y r i b o n u c l e o t i d e t r i p h o s p h a t e e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d e c o l fe s c h e r i c h i ac o l i 脱落酸 拟南芥g 蛋白p 亚基 碱基对 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷酸 乙二胺四乙酸 大肠杆菌 g p r o t e i n h e r e r o t r i m e r i cg t pb i n d i n gp r o t e i n s异三聚体g t p 结合蛋白 g pps u b u n i to fgp r o t e i n g s t g l u t a t h i o n e s t r a n s f e r a s e g s h g l u t a t h i o n e r e d u c e d i p t g i s o p r o p y l p d t h i o g a l a c t o s i d a s e h e p e s g 蛋白b 亚基 谷胱甘肽 s 转移酶 还原型谷胱甘肽 异丙基一d d 硫代半乳糖苷 酶 2 一 4 一 2 一h y d r o x y e t h y l 一1 一p i p e r a z i n y 一e t h a n 4 羟乙基哌嗪乙磺酸 s u l f o n s a u r e l i a c l i t h i u ma c e t a t e n p 4 0 p a g e 乙酸锂 p o l y o x y e t h y l e n en o n y lp h e n y le t h e r 乙基苯基聚乙二醇 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳 v i 扬州大学硕士学位论文 p e g 4 0 0 0 p o l y e t h y l e n eg l y c o l4 0 0 0 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p b s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e r a c k l 聚乙二醇4 0 0 0 聚合酶链式反应 磷酸盐缓冲液 a r a b i d o p s i sr e c e p t o ra c t i v a t e dc k i n a s e1 拟南芥活性激酶c 1 的受体 r a c k lr a c k1d e f i c i e n tm u t a n t s d s s o c u l i u md o d e c y ls u l f a t e t e m e d n n n 矽 n 乒一t e t r am e t h y le t h y l e n e t r i s r a c k l 缺失突变体 十二烷基硫酸钠 n n n 爹 n 参一四甲基乙二胺 2 a m i n o 2 一h y d r o x y m e t h y l 一1 3 p r o p a n e d i o l 三羟甲基氨基甲烷 5 溴 4 一氯一3 吲哚一b d 一半 x g a l 5 b r o m o 4 c h l o r o 3 i n d 0 1 y l p d g a l a c t o s e 乳糖 王连连 拟南芥r a c k i 和a g b i 蛋白的纯化及其相互作用研究 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明 所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研 究成果 除文中已经标明引用的内容外 本论文不包含其他个人或集体已经发表 的研究成果 对本文的研究做出贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式标明 本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 王缒 签字日期 m 口7 年多月 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档 允许论文被查阅和借阅 本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 同时授权中国科学 技术信息研究所将本学位论文收录到 中国学位论文全文数据库 并通过网络向 社会公众提供信息服务 学位论文作者签名 王旺 签字日期 如 9 年多月u 日 导师签名 签字日期 如口 年乡月 i 日 王连连 拟南齐r a c k l 和a g b i 蛋白的纯化及其相互作用研究 第一章文献综述 植物体的新陈代谢和生长发育主要受遗传及环境变化信息的调节控制 一方 面遗传信息决定着植物体代谢和生长发育的基本模式 另一方面这些遗传信息 基 因 的表达及其所控制的生命代谢活动的实现 在很大程度上受控于其所生活的 外界环境 植物的不可移动性使它难以逃避或改变环境 接受环境变化信息 及 时作出响应 r e s p o n s e s 调节适应环境是植物维持生存的出路 经过长期的进化 植物细胞自身已发展形成了一整套及时感知各种环境园子 外部信号 刺激 并 通过适当机制转变为胞内信号 经胞内一系列传导过程 途径 影响相关基因的 表达 最终调控和决定植物生理 生长发育和形态建成等过程 图1 图1 植物细胞信号转导途径示意图 相对于动物细胞 植物细胞信号转导的研究相对较晚 早期关于植物细胞信号 转导的研究大多是跟踪和借鉴动物细胞信号转导的研究思路和技术 在过去的二 十多年中 随着对植物激素等生物体内细胞间信号分子 以及光 辐射 电磁场 温度 水分 甚至病原菌等生物外环境因子对生物体代谢 生长发育的细胞及分 子机理研究的深入 人们对植物细胞信号转导的认识有了长足的发展 模式植物 拟南芥 d r a b t d o p s 缸t h a l i a n a 和水稻 o r y z as a t i v a 基因组全序列的测定完成 以 及对部分基因功能的研究取得重要进展之后 植物科学家们对于植物细胞的信号 转导有了许多更进一步的认识 本章节主要对高等植物g 蛋白介导的信号转导的 机理研究作一概述 一 一 蹦 删 ll 一 n 腓 一 蚺 2 扬州大学硕士学位论文 1 高等植物g 蛋白介导的信号传导研究进展 1 1g 蛋白概述 g 蛋白 gp r o t e i n g t pb i n d i n gp r o t e i n 是指能与鸟嘌呤核苷酸结合 具有g t p 酶 g t p a s e 活性的蛋白质 即具有水解g t p 生成g d p 的特征 g 蛋白参与的信 号转导途径在动植物中是一种非常保守的跨膜信号转导机制 细胞转导胞外信号 时 首先由不同类型的g 蛋白偶联受体 g p c r 接受细胞外各种配基 胞外第一 信使 然后受体活化 进一步激活质膜内侧的异三聚体g 蛋白 后者再去激活其 下游的各种效应器 产生细胞内的第二信使 从而将信号逐渐传递下去 调节生 物的生长发育过程 j o n e sa n da s s m a n 2 0 0 4 g 蛋白是普遍存在于真核生物细胞中的一个g t p 结合蛋白家族 根据其亚基 组成及分子量大小分为两类 一类是与膜受体偶联的异三聚体g 蛋白 h e t e r o t r i m e r i cg t pb i n d i n gp r o t e i n s 分子量较大 10 0 k d 另一类存在于不同的细胞部位 称为 小g 蛋白 s m a l lg t pb i n d i n gp r o t e i n s 分子量小 2 0 3 0 k d 为单体 可能与细胞信号转导无直接联系 孙大业 2 0 0 1 我们通常所说得g 蛋白是指异 三聚体g 蛋白 1 2 植物体异三聚体g 蛋白信号组分 异三聚体g 蛋白介导的信号途径 h e t e r o t r i m e r i cg p r o t e i n m e d i a t e ds i g n a l i n g 存在于许多生物中 在拟南芥 a r a b i d o p s i st h a l i a n a 和水稻 o r y z as a t i v a 等模 式植物中 对异三聚体g 蛋白信号转导途径组分 异三聚体g 蛋白信号转导机制 和异三聚体g 蛋白功能有了较多的了解 g 蛋白信号转导系统是由g 蛋白 g 蛋白偶联受体 g p r o t e i nc o u p l e dr e c e p t o r g p c r 和效应器 e f i e c t o r s 三部分组成 1 2 1 异三聚体g 蛋白 哺乳动物目前发现2 3 种左右的g 仅 6 种g p 1 2 种g y 蛋白 每个亚基都由 多基因编码 从而构成l0 0 0 多种可能的异三聚体g 蛋白 而目前已知的植物中编 码g 蛋白基因的数目非常有限 a s s m a n n 2 0 0 2 在拟南芥中 只有一个典型的编 码g 蛋白c t 亚基的基因 g p a i m a e ta i 1 9 9 0 一个编码b 亚基的基因 a g b i 2 个编码y 亚基的基因 a g g l a g g 2 因此 最多构成2 种可能的异三聚体g 蛋白 即g c t l 3 3 1 和g c q 3 3 2 g 蛋白锚定在细胞膜的内表面 从分子结构上看 静态的g 蛋白由0 p y 三个亚基组成异三聚体 o 亚基相对分子质量一般为3 5 1 0 4 4 5 x 1 0 4 少数相对分 子质量较大 可达6 6 x 1 0 4 7 4 x 1 0 4 p 亚基相对分子质量为3 5 1 0 4 3 6 1 0 4 y 亚 王连连 拟南芥r a c k l 和a g b l 蛋白的纯化及其相互作用研究 基相对分子质量为8 o 1 0 3 1 o 1 0 4 m a s o na n db o t e l l a 2 0 0 1 1 2 2g 蛋白偶联受体 g p c r g 蛋白偶联受体 g p r o t e i nc o u p l e dr e c e p t o r s g p c r 是膜整合蛋白家族中的 成员 g p c r s 的典型特征是它含有七次跨膜的保守区域 j o s e f s s o 和r a s k 1 9 9 7 利用植物表达序列标签 e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s e s t s 与已知哺乳动物g p c r 之 间氨基酸序列的相似性 从拟南芥的c d n a 文库中筛选探针 并克隆到了g p c r 基因 g c r l 的c d n a 序列 其编码的蛋白具有7 次跨膜结构 对此类受体分子 结构研究发现 它们的跨膜结构及信号传递机理非常相似 由一条单肽链形成7 个伐螺旋的跨膜结构 每个疏水跨膜区段均由2 0 一2 8 个氨基酸组成 各区段之间由 数目不等的氨基酸组成的环状结构连接 g p c r 的n 端由3 0 5 0 个氨基酸组成 通 常被糖基化 位于胞外侧 c 端位于胞内侧 目前人们知道 脊椎动物细胞中g p c r 的数目可能高达2 0 0 0 种 编码该类蛋 白的基因占整个基因组的1 以上 由于不同g p c r 在胞外识别序列的差异决定了 受体的特异性 如脊柱动物接受嗅觉及外激素的g p c r 就超过1 0 0 0 种 从而可知 生物细胞精确感知不同信号 在拟南芥中 自j o s e f s s o 和r a s k19 9 7 年克隆出g p c r 基因 g c r l 以来 近期 l i u 等 2 0 0 7 利用拟南芥基因组序列数据库的检索 分析 通过序列比对在拟南芥中鉴定到一种新的g p c r g c r 2 g c r 2 是一种膜蛋 白 a b a 可以与g c r 2 特异性的结合 且这种结合符合配基 受体结合特性 从而 推测g c r 2 是植物激素a b a 的受体 然而 g a o 等 2 0 0 7 对拟南芥中的g c r 2 及它的一种同源物g c r 2 一l i k e l g c l l 在a b a 调控种子萌发和早期幼苗发育中的 作用进行了研究 结果显示 g c l l 功能缺失突变体并没有表现对a b a 的不敏感 效应 他们进一步构建了g c r 2 9 c l l 双突变体 g c r 2 9 c l l 双突变体对a b a 的响应与 野生型类似 在野生型 g c r 2 g c l l 单突变体 双突变体中 a b a 标记基因的转 录均受a b a 的诱导 另外g p a l 基因突变体对a b a 抑制种子萌发和早期幼苗发育 表现十分敏感 应用多重跨膜预测系统 m u l t i p l er o b u s tt r a n s m e m b r a n ep r e d i c t i o n s y s t e m s 进行分析 表明g c r 2 并不是一种七次跨膜蛋白质 因此 g a o 等不支 持g c r 2 是一种a b a 调控种子萌发及早期幼苗发育信号途径中的g p c r 的观点 1 2 3g 蛋白信号调节蛋白 r g s r g s 蛋白 r e g u l a t o ro fgp r o t e i ns i g n a l i n g r g s 是一个蛋白质家族 1 9 9 6 年 三个研究小组同时鉴定到哺乳动物中存在一类新的g a 亚基的g t p 酶活性促 进蛋白家族 r g s 蛋白家族 d r u e y e ta 1 1 9 9 6 k o e l l ea n dh o r v i t z 1 9 9 6 s i d e r o v s k ie t a z 1 9 9 6 每个r g s 蛋白包括r g s 结构域和其它的功能域 在哺乳动物中 r g s 扬州大学颈 学位论文 结构域通过形成一个螺旋结构直接与g 相互作用 r g s 4 和g i a 之间的相互作用 在植物及动物中是保守的 如图2 目前在植物中 对r g s 蛋白了解还很少 拟南芥基因组中含有一个编码r g s i 蛋自的基因 a t r g s c h e ne ta l 2 0 0 3 列与拟南芥基因组序列数据库比对分析 通过对编码哺乳动物r g s 蛋白的基因序 找到了一个与哺乳动物编码r g s 蛋白基 因同源性很高的基因a t r g s 该基因编码的蛋白质a t r g s 的氨基酸序列和其它真 核生物相似 n 末端在细胞外 含有典型的七次跨膜结构域 7 t m 与g 蛋白偶 联受体的拓扑异构结构相似 c 末端在细胞内 含有促g t p 水解酶活性的r g s b o x 应用s p l i t u b i q u i t i n 系统和p u l ld o w n 活体分析技术以及生物学研究证明a t r g s 和 g p a l 相互作用 具有g t p 酶活性 说明r g s l 可能参与了g 蛋白介导的信号转 导途径 泌毋 o s 喇m m 甜 d 啷j 州 n ma l r g 协4 on 舯 n 蝴删r e 9 d 幢3 k 日 o t c d r g s 图2 r g s b o x 与g a 相互作用的模式图 t e m p l ea n dj o n e s 2 0 0 7 当a t r g s 蛋白缺失时 g p a l 可以处于较长时间的活性状态 增强了黑暗条 件下下胚轴细胞的伸长 并且增加了光照条件下根细胞的分化 由此说明a t r g s 在植物细胞增殖过程中是一个关键的调节因子 c h i ne ta l 2 0 0 3 进一步研究表 明a t r g s 在幼苗发育过程中 还参与了糖信号转导 c h e na n dj o n e s 2 0 0 4 r g s l 2 突变体幼苗发育对葡萄糖和蔗糖表现出不敏感 此不敏感性可能并不是渗透胁迫 所引起 推测可能是由糖介导的信号转导途径引起 且不依赖于己糖激酶途径 因此推测葡萄糖对种子萌发的抑制效应是通过提高内源a b a 含量 且a t r g s 在 此途径中作为一个重要的信号分子起调控作用 c h e n 等的研究表明 c o l g p a l 一3 r g s l 一2 三种基因型拟南芥对不同浓度的甘露醇和山梨醇处理 种子萌发时没有明显 的差异 与c o l 和g p a l 一3 相比 r g s l 2 在种子萌发时对高浓度的葡萄糖和蔗糖的 抑制不敏感 这些说明r g s l 2 种子萌发对葡萄糖和蔗糖不敏感是由糖信号而不是 王连连 拟南芥r a c k l 和a g b l 蛋白的纯化及其相互作用研究 三 渗透胁迫引起的 c h e ne ta 1 2 0 0 6 1 2 4g 蛋白下游效应器 o l 亚基与p r 亚基解离后 沿膜脂双分子层的内表面扩散 作用于效应器 首 先发现的g 蛋白效应器是腺苷酸环化酶和视网膜c g m p 磷酸二酯酶 此外 烟草 n i c o t i a n at a b a c u m 中的磷脂酰肌醇特异的磷酸脂酶c p i p l c 川百合 l i l i u m d a v i d d i 中的两个p i p l c l d p l c l l d p l c 2 大麦 h o r d e u mv 堙a r e 中的磷 酸脂酶d p l d 烟草和蔷薇科植物p r u n u s p e r s c i a 中的钙调蛋白 c a m 拟南 芥中的钾离子通道和阴离子通道 番茄中的钙离子通道等也可能是g 蛋白的下游 效应器分子 a h a r o ne ta 1 1 9 9 8 r i t v h i ea n dg i l r o y 2 0 0 0 a p o n ee ta 1 2 0 0 3 s u ne t a 1 2 0 0 3 p a ne ta 1 2 0 0 5 h u a n ge ta 1 2 0 0 6 现有研究表明 p 丫亚基能够直接激活 一些p l c 2 1 3 异构体 p l c 2 1 3 1 和p l c 2 1 3 3 较p l c 2 1 3 2 和p l c 2 p 4 更易受g q 家族 c 亚基的激活 p l c 2 p 2 和p l c 2 1 3 3 较p l c 2 1 3 1 易受p 丫亚基激活 p l c 2 p 4 不能被p 丫 亚基激活 m c c u d d e ne ta 1 2 0 0 5 1 3 异三聚体g 蛋白偶联信号途径 在高等真核生物中 异三聚体g 蛋白参与的跨膜信号转导途径是一种常见且 保守的作用机制 在细胞学说中 外界环境信号主要被位于细胞表面的受体所接 受 通过一种跨膜信号转导机制 将细胞外信号传递给胞内信使 后者再进一步 向下转导引起胞内产生一系列生理生化反应和表现相应遗传性状 异三聚体g 蛋白偶联信号途径中 g 蛋白作为分子开关 转导来自g 蛋白偶 联受体所接受的信号 激活相应的效应器 产生第二信使 引起细胞内相应的生 物反应 当特异性的配体与膜上的g p c r 结合后 活化的g p c r 激活相应的g 蛋 白 催化g 蛋白a 亚基结合的鸟苷二磷酸 g d p 替换为鸟苷三磷酸 g t p 从而 使0 亚基构象改变 降低0 亚基与p 丫亚基的亲和力 使异三聚体解离为g a g t p 和g p 丫 解离的g 0 l g t p 和g p l 分别调控下游各自的效应器 产生第二信使 引发胞内相关基因的表达 最终诱导细胞的生理生化反应 当g a 亚基利用自身的 g t p 水解酶活性催化g t p 水解为g d p 使g a g d p 与效应物解离 并重新结 合g p 丫 形成非活性的异三聚体g 蛋白 g 蛋白信号转导调节因子r g s 蛋白作为 g t p a s e 激活蛋白 g t p a s e a c t i v a t i n gp r o t e i n g a p s 可以加速g c t 亚基利用自身 的g t p 水解酶活性催化g t p 水解为g d p 从而当配体与膜上受体g p c r s 分离后 缩短了g 蛋白介导的信号转导持续时间或加速g 蛋白介导的信号转导的终止 j o n e sa n da s s m a n n 2 0 0 4 异三聚体g 蛋白广泛参与了植物发育和跨膜信号转导过程 包括激素信号转 扬州大学硕 学位论文 导 生长素 g a a b a 病原信号转导以及光信号转导和光控发育 干旱刺激 胞外钙调索等 它们与植物的生长 发育和抗性形成密切相关 a s s m a n n 2 0 0 2 近年来利用分子生物学手段使相关基因超表达或缺失突变 使得研究工作进展迅 速 13 1g 蛋白与激素信号转导 植物激素作为内源性调节物质 对植物体生长发育起着广泛的调节作用 植物 细胞中可能存在多种激素受体 但人们有关植物激素被受体接受后的信号转导过 程知之甚少 0 蛋白广泛参与植物激素的信号转导途径 图3 以下主要介绍三 种激素信号 o 一嚣 图3 拟南芥和水稻中与g 蛋白有关的信号转导途径 p e r f u se ta l 2 0 0 4 l 5e口s iue l 12u一 莹 e pl 王连连 拟南芥r a c k l 和a g b l 蛋白的纯化及其相互作用研究 1 1 3 1 ig 蛋白介导的生长素信号转导 早在l9 9 0 年z a n i a 等就发现i a a 可以促进g 蛋白循环过程 而g 蛋白也可 以以某种方式抑制i a a 与受体结合 z a n i ae ta 1 1 9 9 0 n a t o 等 n a t oe t 口 1 9 9 7 以生化检测等手段测定表明 g 蛋白在小麦的体细胞胚中表达 且对生长素敏感 u l l a h 等 2 0 0 1 对g p a l 的功能缺失和过表达突变体研究结果表明 至少生长素 作用的信号转导途径之一需要g a 参与 但还不清楚植物体感受生长素信号后是如 何将其与质膜内侧的o a 联系在一起 从而进一步调节细胞周期的 u l l a h 等研究发现 g 蛋白亚基的功能缺失突变会影响由生长素介导的拟南芥侧 根及不定型根的形成 过表达g a 亚基g p a l 的植株与a g b l 突变体植株都表现出对生 长素超敏感 过表达g b 亚基a g b l 的植株对生长素的敏感度下降 g a 亚基组成型 表达的突变体与野生型表型相同 但是过表达不能与g p 丫二聚体亚基结合的o a 亚基 则不能增加植株对生长素的敏感性 这个实验结果说明了g p y 二聚体亚基对生长素 诱导的细胞分裂具有负调控作用 而g a 亚基通过与g p l 结合 从而抑制其作用 这 些都证明了g b 亚基作为生长素信号通路的上游调控元件调节着生长素在细胞内的 活 u l l a he ta i 2 0 0 3 然而 无论是g p a l 还 是a g b l 都不能致死 g d 亚基突变体中 大约只有三分之一的生长素调节基因失去功能 u l l a he ta i 2 0 0 3 说明了g 蛋白不 与生长素信号通路直接相关 或是生长素的信号途径有很多支路 g 蛋白只参与调 节其中一部分 已知动物中游离的g a b 可以激活分裂素激活蛋白激酶 m i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e m a p k 而k o v t u n 等 1 9 9 8 发现植物体中活化的m a p k 参与受 生长素诱导的基因转录的调节 因此可以推测 植物生长素信号转导途径中g 蛋 白的下游可能是通过m a p k 来调节基因表达的 1 3 1 2g 蛋白参与的a b a 介导的信号转导 植物激素a b a 参与了许多生理 生化和发育过程以及响应生物和非生物逆境 等过程的调节 许多研究结果表明 植物细胞内至少存在一条依赖a b a 的信号转 导途径和一条不依赖于a b a 的信号转导途径 v e r s l u e se ta 1 2 0 0 7 近年来的研究 表明 g 蛋白参与了a b a 介导的信号转导途径 w a n g 等 2 0 0 1 研究发现 在拟 南芥g p a l 突变体中 a b a 不能抑制保卫细胞k 内向通道 也不能激活s 型阴离子通 道来抑制气孔开张 这表明a b a 信号途径与g 蛋白是相偶联的 然而有趣的是 由 a b a 引起细胞p h 变化来促进气孔关闭的过程没有因为g p a i 功能的缺失而受影响 揭示了a b a 诱导的促进气孔关闭和抑制气孔开张不是简单的互逆过程 在保卫细 胞中也存在不依赖于g 蛋白的a b a 信号途径 p a n d e y 和a s s m a n n 2 0 0 4 的研究发 现 在a b a 信号转导中 异三聚体g 蛋白可能还参与拟南芥根生长的调节 当用 扬州大学硕士学位论文 a b a 处理时 主根伸长受抑制或主根生长方向改变 g p a l a g b l g c r l 单突变体以 及它们的双突变体和三突变体的主根延伸对a b a 引起的抑制比野生型敏感 a b a 还参与调节种子萌发 幼苗生长等生理活动 p a n d e y 与c h e n 等研究发现 g p a l 与 a g b l 突变体在种子萌发过程中对a b a 超敏感 g c r l 也表现为对a b a 超敏感 不仅 如此 g c r l g p a l y 叹突变体 与g p a i 表型相同 g c r l a g b l y 叹突变体则 与a g b i 表型相同 g c r l g p a l a g b l 突变体表型与a g b l 表型相同 这些结果说明了 在种子萌发过程中 g c r l 作为g p a l 与a g b l 上游效应因子 对a b a 信号途径起负调控作用 p a n d e ye ta 1 2 0 0 6 1 3 1 3g 蛋白参与g a 介导的信号转导 j o n e s 等 1 9 9 8 的研究表明 燕麦糊粉层细胞中 肥大脱粒肽 m a s t o p a r a n 以g a 3 类似的作用方式诱导糊粉层细胞原生质体的a 一淀粉酶基因的表达及蛋白分 泌过程 g t p y s 促进g a 引起的0 一淀粉酶基因启动子g u s 报告基因的表达 而g d p l 3 s 则抑制上述表达 f u j i s a w a 等 1 9 9 9 将水稻异三聚体g 蛋白0 亚基的反义c d n a 转 入水稻 发现转基因水稻表现出明显的植株矮化和种子缩小的表型 证实异三聚 体g 蛋白参与了水稻节间和种子发育的调节 进一步应用限制性片段长度多态性 r f l p 分析表明 水稻g a 基因位于第5 条染色体上 与水稻中发现的矮化突变 体d a i k o k ud w a 产j d o 的突变位点紧密连锁 于是人们将g a 不敏感的水稻突变体 d w a 矿朋勺基因克隆并进行分析发现 d w a 矿j 基因编码的蛋白就是g 蛋白仅亚基 证 实异三聚体g 蛋白确实参与了g a 的信号转导过程 u 1 1 a h 等 2 0 0 2 的研究表明 在拟南芥种子萌发过程中 g p a l 突变体表现出对g a 的不敏感 而对g a 合成抑制剂 p a c l o b u t r a z o i 以及a b a 的敏感度都增加了 过表达g p a l 的拟南芥种子对g a 的敏感 度大大上升 但萌发仍需要g a 这些说明g 蛋白影响g a 信号通路 但不与其直接 偶联 他们还发现b r 合成受阻的突变体d e t 2 一 以及b r i l 5 对g a 的敏感性与g p a l 相 似 由此推测g p a l 通过b r 来调控g a 的信号通路 u l l a he ta 1 2 0 0 2 c h e n 等随后发现 在种子萌发过程中 g c r l 对g a 以及b r 几乎不敏感 这 与g p a l 的表型十分相似 有趣的是 g c r i g p a l a g b l 突变体在对g a 敏感度上 表现出叠加效应 故推测g c r l 可以不依赖于g 蛋白 单独调节g a 与b r 信号 c h e r t 仑fa 1 2 0 0 4 1 3 2g 蛋白与病原信号转导 b e f f a 等 1 9 9 5 最早提供直接证据表明异三聚体g 蛋白参与了植物病原信号 的转导 x i n g 等 19 9 7 也认为在病原激发子信号的早期阶段需要活化的g 蛋白 参与 他们发现激发子作用于宿主 番茄 细胞时 可引起质膜上h a t p a s e 的 去磷酸化 这与没有激发子作用时 g 蛋白活化剂处理番茄细胞所产生的效应相同 王连连 拟南芥r a c k l 和a g b l 蛋白的纯化及其相互作用研究 用霍乱素 c h o l e r at o x