（遗传学专业论文）废水处理系统生物膜中细菌的共凝集.pdf

苏州大学学位论文使用授权声明 本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献 信息情报中心、中国科学技术信息研究所( 含万方数据电子出版社) 、 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索。 涉密论文口 本学位论文属 在年一月解密后适用本规定。 非涉密论文囱 论文作者签名：拙e t 毒师签名：塾室主塑e l 期；叫! ：! ：翌 废水处理系统生物膜中细菌的共凝集中文摘要 中文摘要 共凝集是不同的细菌通过特殊的分子相互粘连在一起的过程，这种粘附影响 复杂的多种群生物膜的形成。生物膜是自然固定化的微生物群落，定殖于生物膜 中的细菌能更持久稳定的留存在环境中，虽然自然界中大多数细菌都有一定的生 物膜形成能力，但能力的强弱却有很大差异。以生物膜形式生长的细菌对抗生素 等杀菌剂，恶劣环境，及宿主免疫防御机制有很强的抗性。在污水处理系统中， 将具有广泛共凝集能力的架桥细菌和降解菌混合投加，增加降解菌进入生物膜中 的机会，能够解决污水处理系统中降解菌不易长期定植的缺点。 本文从不同废水处理系统生物膜中分离到2 2 株细菌，测定了它们的共凝集能 力，并通过1 6 sr r n a 序列分析对未知细菌进行了鉴定。2 2 株细菌组合形成2 6 3 个配对，其共凝集结果显示，2 h 和2 0 h 时b a c i l l u sc e r e u sg 5 与其他2 1 株细菌的共 凝集率分别达到3 0 和4 5 以上，b a c i l l u sm e g a t e r i u mt l 与其他1 7 株细菌的共凝 集率分别达到3 4 和4 5 以上，同属于s h e w a n e l l a 茵属的h 2 和h 3 菌株与其它 1 6 株细菌配对的共凝集率，2 h 时达到3 0 7 5 ，2 0 h 时达到4 0 8 2 ；对g 5 和 t l 与其他2 1 株细菌共培养的生物膜形成能力进行测定后，结果显示1 5 株细菌与 g 5 混合培养、1 6 株细菌与t l 混合培养的生物膜形成量高于单菌培养的生物膜形成 量，表明g 5 和t l 与其它2 1 株细菌中的大多数细菌混合培养时增加了生物膜形成 量。两株菌在5 的l b 培养基中的成膜能力均普遍超过了0 2 5 。试验结果表明这 2 种有广泛共凝集能力的细菌具有将多种细菌固定于生物膜的功能。 关键词：共凝集生物膜架桥细菌 作者：杜青珍 指导老师：孟祥勋教授 a n dt h ew e a kd i f f e rg r e a t l y t h eb a c t e r i al i v i n gb yb i o f i l mh a v eh i g h l yr e s i s t a n tt o d i s i n f e c t a n t , s e v e r ee n v i r o n m e n t ，h o s ti m m u n er e s p o n s ea n ds oo n i nt h ew a s t e w a t e r t r e a t m e n tp r o c e s s e s ，i no r d e rt oi n c r e a s et h ep r o b a b i l i t yo fd e g r a d i n gb a c t e r i ae n t e r i n gt o b i o f i l m ，w e m i xb r i d g i n gb a c t e r i u ma n d d e g r a d i n g b a c t e r i aw i t l le x t e n s i v e c o a g g r e g a t i o na b i l i t y ，t h i sw a yc a ns o l v et h ep r o b l e mt h a td e g r a d i n gb a c t e r i ac a n t p e r m a n e n t l yp l a n ti nt h ew a s t e w a t e rt r e a t m e n tp r o c e s s e s i s o l a t e2 2s t r a i n so fb a c t e r i af r o md i f f e r e n tw a s t e w a t e rt r e a t m e n tp r o c e s s e sb i o f i l m ， q u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n e dt h e i rc o a g g r e g a t i o na b i l i t y , a n di d e n t i f yu n k n o w nb a c t e r i ab y 16 sr r n a s e q u e n c ea n a l y s i s 2 2s t r a i n so f b a c t e r i ac a nc o m b i n e2 6 3p a i r i n g ，t h er e s u l t s h o w st h a tt h ec o a g g r e g a t i o np e r c e n t a g eo fb a c i l l u sc e r e u sg sw i t ho t h e r21s t r a i n s r e a c h e dm o r et h a n3 0 a n d4 5 ，a n db a c i l l u sm e g a t e r i u mt i 谢t l lo t h e r17s t r a i n so f b a c t e r i ar e a c h e dm o r et h a n3 4 a n d4 5 i nt h e2 ha n d2 0 h t h ec o a g g r e g a t i o n p e r c e n t a g eo fh ea n dh 3b e l o n g i n gt o s h e w a n e l l aw i t ho t h e r16s t r a i n so fb a c t e r i a r e a c h e d30 7 5 i nt h e2 h a n d4 0 8 2 i nt h e2 0 h ；t h ea b i l i t yo fb i o f i l mf o r m a t i o n c o c u l t u r e db yg 5a n dt 1w i mo t h e r2 1s t r a i n sf u r t h e rs h o w st h a tt h eg sa n dt i i m p r o v e dt h eb i o f i l mf o r m a t i o no fs i n g l eb a c t e r i a t h ea b i l i t yo fb i o f i l mf o r m a t i o no f t h e2s t r a i n so fb a c t e r i ag e n e r a l l ye x c e e d si n5 l bc u l t u r em e d i u m t h ee x p e r i m e n t r e s u l t ss h o w st h a tt h e2s t r a i n so fb a c t e r i aw i t ha b i l i t yo fe x t e n s i v ec o a g g r e g a t i o nc a n l l t h ec o a g g r e g a t i o no f t h eb a c t e r i ai nt h ew a s t ew a t e rt r e a t m 塑! 里! 堕! ! ! ! ! 里! 旦鱼堑! 垒皇! 堕璺璺 f i xm u l t i b a c t e r i ao nb i o f i l m k e yw o r d s ：c o a g g r e g a t i o n b i o f i l m b i r d g i n gb a c t e r i u m i i i w r i t t e nb yd uq i n g z h e n s u p e r v i s e db ym e n gx i a n g x u n 目录 前言- l刖舌”? l 第一章综述2 1 我国的水资源分布及污染现状2 2 污水处理常用方法的研究2 2 1 活性污泥法3 2 2 生物接触氧化法3 2 3 生物膜法4 3 生物膜的研究进展4 3 。l 生物膜的形成与调控机制4 3 1 1 生物膜4 3 1 2 生物膜的形成机制4 3 2 影响生物膜形成的因素6 3 2 1 共凝集等影响膜形成的生物因素6 3 2 2 生物膜形成过程中非生物因素的影响”1 0 4 生物膜法污水处理l l 4 1 生物膜应用到污水处理领域的优势”1 2 4 2 生物膜在有毒物质降解中的应用进展1 2 4 3 生物膜在水体脱氮中的应用进展1 3 4 4 生物膜法污水处理的实际应用13 5 本研究的目的和意义1 3 第二章生物膜中细菌的分离1 5 1 生物膜中细菌的筛选l5 1 1 材料“1 5 1 2 方法“1 6 2 菌种的保存1 8 2 1 材料“18 2 2 方法18 3 结果与分析1 9 3 1 菌种形态及生理生化鉴定结果与分析4 6 3 2 分子鉴定结果与分析”4 8 4 讨论5 2 第六章问题与展望5 3 参考文献5 4 硕士学习期间发表论文6 0 致谢6 1 废水处理系统生物膜中细菌的共凝集前言 上_ j 一 月i j舌 向化工废水处理系统投加高效降解菌的生物强化( b i o a u g m e n t a t i o n ) 技术已成 为一项有效降解复杂有机物的方法，但在实际废水处理中常因降解菌的流失而无 法长期维持良好的处理效果。 生物膜是自然固定化的微生物群落，相对于浮游细菌，生物膜中的细菌能更 持久稳定的存在于废水处理系统中，而且对恶劣环境具有更强的抵抗力。近年来 对生物膜形成机理的研究揭示，一些具有广泛共凝集能力的细菌能与多种无亲缘 关系的细菌联接在一起，发挥着桥梁的作用，在多菌种生物膜形成中这种架桥细 菌( b r i d g i n gb a c t e r i u m ) 可以将多种能与其发生共凝集的细菌组合进生物膜，成为 生物膜的一员。在生物强化处理中，如能以架桥细菌为桥梁，通过其共凝集能力 将投加的降解菌组合进生物膜，这将是更趋近自然、更简便的微生物固定化方式。 本研究先后从废水处理系统的生物膜上分离到多株细菌，对它们的共凝集能 力和生物膜形成能力进行了测定，旨在寻找具有高强度或广泛共凝集能力的细菌， 为生物强化处理中投加的降解菌能固定于生物膜寻找新的功能微生物资源。 第一章综述 废水处理系统生物膜中细菌的共凝集 第一章综述昂一早综尬 1 我国的水资源的分布及污染现状 我国水资源总量2 8 万亿立方米，居世界第6 位，水资源可利用量8 ，1 4 0 亿立方 米，人均水资源的占有量却仅为世界人均水平的1 4 。居世界第1 0 9 位，被联合国列 为4 0 个严重缺水国之一【。人均占有量少是我国水资源的主要压力，水污染又进一 步加剧了水资源的短缺。 据有关资料统计，我国近8 0 的生活污水不经处理，直接排入江河湖海，年 排污量达4 0 0 亿m 3 ，直接造成全国1 3 以上的水域受到污染。造成我国水污染严重的 主要原因之一是城市化和工业化进程的加快，城市污水产生量迅速增加，但城市 污水处理设施严重滞后，污水处理率很低，使得水环境污染日益严重。 一般来说，污水的主要成分仍然是水，全部固体物质仅占0 1 或者更低。这 些固体物质在水中以悬浮态、溶解态和胶体状态三种形式存在。按其化学性质可 以分为无机物和有机物。无机污染物主要包括无机盐( s 0 4 扣，c 1 。和s 2 等) 、酸、碱、 重金属离子( 如h g 、c d 、c r 、p b 、z n 、c u 等) 、毒性无机物( 如c n 一和a s 等) ，以 及n 、p 等植物性营养物质。有机污染物成分复杂，主要有蛋白质( 4 0 6 0 ) ，碳 水化合物( 2 5 。5 0 ) 和油脂( 1 0 ) ，此外还有一定量的尿素。有机污染物的共同 特点就是不稳定，在水环境中十分容易被氧化分解，大量消耗水中的溶解氧，造 成水体溶解氧的含量大幅下降，在缺氧和厌氧的条件下，微生物容易发生腐败发 酵，释放出h 2 s 、n h 3 和c h 4 等有毒并具有特殊气味的气体，其中一些气体还可以 溶解在水中，改变水的p h 值，破坏水体。另外，大多数病原微生物能够以水中的 有机物为食，水中有机物的增多，为微生物的滋生创造了更为有利的条件，也意 味着水传播疾病的几率增加。因此，控制与去除水中的有机污染物是污水处理工 程中的主要任务之一；把污水中携带的污染物质，通过微生物的代谢活动予以转 化与稳定，是污水生物处理的主要目的【2 1 。 2 污水处理常用方法的研究 目前，世界各国均非常重视水污染的处理问题，常用的污水处理方法有：物 理化学法、臭氧活性炭联用处理技术、微生物处理技术、点水处理技术、膜分离 2 废水处理系统生物膜中细菌的共凝集第一章综述 技术等3 , 4 , 5 , 6 】。自18 8 2 年首次进行向污水中鼓人空气的试验后，生物污水处理技术 逐渐发展成一种独立的污水处理方法，并在污水处理领域中占有重要地位。它以 成本低、出水水质较好、且污泥肥分高等优点，而被世界各国广泛采用。微生物 污水处理技术是利用微生物代谢作用中产生的酶来氧化分解有机污染物，从而达 到净化污水的目的【7 ，8 】。 多年来，我国采用的微生物污水处理常用的方法主要有活性污泥法、氧化法 和生物膜法等。 2 1 活性污泥法 我国的城市生活污水处理多采用活性污泥法，特点是处理能力高，出水水质 好。该法主要由曝气池、沉淀池、污泥回流和剩余污泥排放系统组成。废水和回 流的活性污泥一起进入曝气池形成混合液。曝气池是一个生物反应器，通过曝气 设备通入空气，空气中的氧融入混合液，搅拌使混合液呈悬浮状态，充分接触， 产生好氧代谢反应，随后混合液进入沉淀池，固体沉降和水分离，流出沉淀池的 就是净化水。沉淀池中的污泥大部分回流，少部分增殖的微生物量从沉淀池中排 除。随着工艺的发展，活性污泥法又衍生出许多改良方法，比如：采用了两次生 化处理的a b 法，工艺单元的构成较复杂，管理环节较多，但对于高浓度的污水效 果较好；氧化沟法是一种底负荷的污水处理工艺，出水的水质好，负荷低，沉淀 池和曝气池组合为一，简化了工艺，管理也相对简单的多，但增加了污水处理设 施的建设投入。 整体来说，在实际操作过程中，活性污泥法往往成本过高，限制其推广利用。 2 2 生物接触氧化法 氧化法是目前广泛采用并极具发展潜力的城市生活污水预处理方法之一，根 据氧化剂的种类及反应器的类型，氧化法可分为化学氧化法，催化氧化法，( 催 化) 湿式氧化法，光催化氧化法，超临界氧化法等。化学氧化法操作简单，但是 成本高，效果也不太理想。 生物接触氧化法是一种介于活性污泥法与生物滤池之间的处理工艺，又称淹 没式生物滤池。这种方法一般由池体、填料、布水系统和曝气系统组成，特点是 污泥龄长，传质条件好，充氧效率高。 一些氧化技术现在国内外研究非常活跃，有可能成为2 l 世纪废水处理领域中 第一章综述废水处理系统生物膜中细菌的共凝集 的重要方法之一。 2 3 生物膜法 生物膜法污水处理技术将在后面的文章中介绍。 3 生物膜的研究进展 3 1 生物膜的形成与调控机制 3 1 1 生物膜 细菌生物膜( b i o f i l m ，b f ) ，国内也有学者译为生物被膜，是指附着于有生命 或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体【9 , 1 0 , 1 1 】。在自然界、 某些工业生产环境( 如发酵工业和废水处理系统) 以及人和动物体内外，绝大多数细 菌是以生物膜方式生长，而不是以浮游方式生长【1 2 】。形成生物膜的细菌在物体表面 形成高度组织化的多细胞结构，致使同一菌株的生物膜生长模式和浮游生长模式 具有不同的特性。细菌镶嵌在多聚物的外表面，在这种自然固定化的群体中可在 一定程度上通过基因表达谱的变化来适应其它菌株的存在，展现出许多表型的改 变，如细菌生理学、代谢机制和基因转录的改变等，这样衍生出的微生物群落具 有更强的稳定性和适应能力【1 3 , 1 4 。 生物膜的结构非常复杂，其中水份含量可高达9 7 ，除了水和细菌外，还含 有细菌分泌的大分子多聚物如蛋白质、多糖、吸附的营养物质和代谢产物及细菌 裂解碎片等【1 5 】。有研究表明，d n a 也是生物膜的一个重要成分1 6 1 。生物膜结构具 有一个非常重要的特点就是异质性。尽管生物膜结构复杂，生物膜内部细胞获得 营养有三种解决方案【1 7 】：一是位于生物膜中心或底部的细胞基本处于静止状态， 新陈代谢缓慢，减少对营养物的需求；二是生物膜中存在微小的水流通道，增加 生物膜的表面积和对流转运能力；三是菌体从生物膜上脱落，释放出小块生物膜 和单个细胞，从而获得更多的营养。 3 1 2 生物膜的形成机制 当细菌的生存受到各种压力，如极端的营养缺乏或过剩、低p h 值、高渗透压、 氧化、抗菌剂和抗生素等，为了对抗不利的环境，通过自身合成水合多聚物，粘 附在固体表面生长从而形成生物膜，这是细菌所具有的一种非常重要的环境适应 机制【1 蚋。 4 第一章综述 菌起始粘附、生物膜生长和成熟等 特l 生【12 1 。 步，仅有少量胞外聚合物的浮游细 菌随机的黏附到固体表面，这些细菌仍然可以局部运动，甚至可以重新进入浮游 状态，所以这种黏附是可逆的。 3 1 2 2 生物膜的生长期 黏附之后的细菌除正常的生长繁殖外，迅速调整基因的表达，在基因的控制 下大量的分泌胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r i d e ，e p s ) ，e p s 分子对于生物膜的形成非 常重要【1 9 】，它可以牢固的，不可逆的粘结单菌形成微菌落，大量微菌落使生物膜 加厚。研究表明，胞外多糖不是最初的细菌表面附加物所必须的，但是是所有的 生物膜基质构成的重要部分【2 0 1 。生物膜可由纯菌种形成，但大多数是多种不同的 细菌，不同菌种在不同的时间和空间发展，存在菌种的交替演变，例如，好氧菌 和兼性厌氧菌的生长消耗氧气，从而可以造成局部的厌氧微环境，为厌氧菌的生 长提供条件。另外，在生物膜的生长期，细菌对外界环境的抵抗力已显著提高。 3 1 2 3 生物膜的成熟期( m a t u r a t i o n ) 成熟的生物膜具有有组织的高度不均质结构，由类似蘑菇的微菌落组成，微 菌落的间隙中围绕着可以运送水、养料、酶、代谢产物和废物的输水通道。有人 将成熟的生物膜内部结构比喻为原始的循环系统。生物膜形成的微环境如营养、 菌种、环境压力等直接影响生物膜的形成。另外，研究表明，生物膜成熟期菌种 表达的蛋白与浮游状态下的蛋白表达有着本质的不同。【2 1 】 3 1 2 4 生物膜的播散期( d e t a c h m e n t ) 成熟的生物膜通过蔓延、部分脱落释放出浮游细菌或者生物膜小团，从生物 膜中扩散和播散出来的细菌又可以在物体表面形成新的生物膜。活跃的播散是一 种生理调控。 第一章综述废水处理系统生物膜中细菌的共凝集 图1 细菌生物膜形成的过程 1 粘附期：浮游细菌粘附于物体表面；2 种植期：细菌分裂繁殖，分泌胞外基质，形成微菌落； 3 生长期：微茵落相互融合发育，形成生物膜；4 成熟期：发育成熟的生物膜；5 播散期：细 菌从生物膜释放出来，形成新的生物膜。f 2 2 1 3 2 影响生物膜形成的因素 3 2 1 共凝集等影响生物膜形成的生物因素 3 2 1 1 共凝集作用 共凝集是不同的细菌通过特殊的信号识别分子相互粘连在一起的过程，这里 的不同菌株既包括相同属又包括不同属的菌株【2 3 1 。同理，自凝集是指同一种细菌 之间的相互黏附。凝集反应是由凝集双方之间互补的凝集素和糖类物质高度特异 性的相互识别过程2 4 1 。凝集作用最初是在牙菌斑中被发现并广泛研究的【2 5 2 6 1 ，在 宿主牙齿表面，牙菌斑的形成过程中，种内的凝集和种间的凝集都起了关键作用。 研究表明，这种通过凝集素糖类物质介导的凝集反映，可以通过加入单糖和鳌合 剂来逆转，但在遗传上非常的稳定，它既不会受到凝集双方的胞龄影响也不会受 到所用培养基的影响【2 7 1 。 6 废水处理系统生物膜中细菌的共凝集第一章综述 生物膜的发生过程可以通过黏附和繁殖过程的演替来展现。第一个连接在基 质表面的生物体就是初级连接体，并且初级连接体可以通过一种被吸附的、有机 膜的成分的特异的或非特异的理化作用被调停【2 8 , 2 9 , 3 0 】。如果条件合适，初级连接体 可以在基质上增殖形成聚合体。当聚合体内部的环境条件发生改变，并且基质被 细菌所覆盖时，次级连接体开始连接到初级连接体上，生物膜开始向多样化发展。 共凝集作用可以通过两条途径为生物膜的发展发挥作用。第一条途径是通过 悬浮生活环境中单个细胞确认，这种反映由细胞膜中的特定遗传性状介导，具有 特异性。第二条途径是次级连接体在悬浮液中的前期聚合，随后通过聚合体共同 黏附到已有生物膜表面。在两个过程中，悬浮生活环境中的细菌细胞通过相互吸 引特异性地黏附到生物膜 3 1 , 3 2 。相互吸引的细菌随后就会成为生物膜体系的一 部分。 图2 共凝集在多种生物膜形成过程中可能扮演的角色 ( a ) 在培养基表面形成由多糖和蛋白质组成的初级连接体 ( b ) 细胞分裂生长，分泌胞外多糖，形成微茵落 ( c ) 单个细菌，共凝集的细菌团或自凝集细茵团进入新生成的生物膜 ( d ) 生成成熟生物膜1 3 3 】 近年来对生物膜形成机理的研究揭示，一些细菌具有广泛的、可以和其它许 多不同类型的细菌进行共凝集的能力，我们称之为具有广泛的共凝集能力。这些 7 述 废水处理系统生物膜中细菌的共凝集 把多种无亲缘关系的细菌联接在一起，发挥着桥梁的作用，我们称之为 ( b r i d g i n gb a c t e r i u m ) 3 4 , 3 5 。在多菌种生物膜形成中这种架桥细菌可以将多 发生共凝集的细菌组合进生物膜，成为生物膜的一员。 1 1 医学领域对有广泛共凝集能力的细菌的研究进展 斑是研究最早也是最广泛的生物膜系统，k o l e n b r a n d e r 等人【3 6 , 3 7 对1 千多 菌共凝集能力的研究发现具核梭杆菌( f u s o b a c t e r i u mn u c l e a t u m ) 有广泛的 力，它能与多种无亲缘关系的微生物连接在一起，发挥桥梁的作用，首先 核梭杆菌作为架桥细菌的地位 3 8 】。对架桥细菌广泛共凝集机理的研究揭 杆菌至少有三个单独的凝集素分子，这些分子可调停来自牙齿表面的七 属细菌的共凝集。具核梭杆菌细胞表面多种凝集素分子的存在使其能与 凝集，并将与其发生凝集的微生物组合进生物膜，成为多菌种生物膜的 一员。 s s h e n ，l p 等人【3 3 】发现从牙菌斑中分离的菌株中可以发生比较明显的种间凝 集反应有：a c t i n o m y c e s s p 和v e i l l o n e l l as p ， a c t i n o m y c e s i s r a e l i i和 p e p t o s t r e p t o c o c c u s p r e v o t i i ，c a m p y l o b a c t e rg r a c i l i sa n da c t i n o m y c e ss p 等等。【3 4 】 我们曾一度认为这种聚合只发生在牙齿表面的细菌，但越来越多的报道表明 这种聚合也发生在另外的一些地方的生物膜的细菌。近年来，通过对哺乳动物小 肠、人类泌尿系统管道和饮用水供给系统的生物膜中分离出的细菌进行的研究， 发现特定遗传性状菌株间的黏附是很普遍的现象。随着对口腔以外的环境中的生 物体凝集研究的拓展，表明凝集在多种不同生物膜的发展中扮演了重要的角色【3 9 1 。 3 2 1 1 2 环境领域对有广泛共凝集能力的细菌的研究进展 已经有很多的研究者从不同的水体中分离筛选出一些架桥细菌，它们所属的 属非常广泛，如b u s w e l l 等人【删从人工的生物膜模型中分离出的藤黄微球菌 ( m i c r o c o c c u sl u t e u s ) 具有很强的共凝集能力，能与1 9 株水生细菌中的1 1 株发生共 凝集，在生物膜的形成过程中扮演了架桥细菌的角色。r i c k a r d 等【4 1 】研究了来源于 淡水生物膜和同一环境中浮游细菌的共凝集能力，来源于生物膜的分属1 4 个属的 2 9 株细菌所有的配对组合中2 3 4 的配对菌表现出共凝集能力，而来源于浮游细 菌，分属于7 个属的1 5 株细菌其所有的配对组合中仅有5 8 的配对菌表现出共凝集 能力，相对于浮游细菌，生物膜中的细菌具有共凝集能力的比例更高，有理由认 废水处理系统生物膜中细菌的共凝集第一章综述 为在高剪切力的淡水环境下共凝集能力可以影响生物膜的形成和生物膜内菌种的 多样性。m a l i k 等【4 2 】从下水道活性污泥中分离到3 2 株菌并测试了菌株间的共聚集能 力，发现菌株约氏不动杆菌似c i n e t o b a c t e r j o h n s o n i is 3 5 ) 能与7 个种属的菌株发生显 著的共聚集，显示了其架桥微生物的角色。l u c i ac h a v e ss i m o e s 4 3 】等人通过试验发 现来源于应用水中的醋酸钙不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s ) 不但自凝集能 力强，还可以特异的和其余的5 株分离菌中的4 株发生共凝集( b u r k h o l d e r i a c e p a c i a 朋e t h y l o b a c t e r i u ms p ，m y c o b a c t e r i u mm u c o g e n i c u m ，s p h i n g o m o n a sc a p s u l a t a ， a n ds t a p h y l o c o c c u ss p ) 发生明显的共凝集，如果彳c 砌p 幻6 口c 胞，c a l c o a c e t i c u s 缺失则 无法观察到共凝集，证明了a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s 可以在多菌种生物膜的形成 中作岁j 架桥细菌。在不同的生物膜体系中，如牙菌斑生物膜、淡水生物膜群落中、 活性污泥中的生物膜群落以及人工模拟的生物膜中，已经证实特异性的共凝集作 用在多菌种生物膜的发展和保持密切相关，强共凝集能力很大程度上影响生物膜 的形成。 目前，环境领域对有广泛共凝集功能的细菌的凝集机理的研究比较少。2 0 0 8 年s i m e s 等脚】对架桥细菌a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s 的凝集机理进行了初步研究， 发现加热处理和蛋白酶处理可导致细菌间共凝集能力的丧失，而乳糖、半乳糖、 海藻糖的添加可使细菌间的共凝集能力受到影响，证明表面蛋白和多糖在架桥细 菌与另外4 种细菌的共凝集中扮演了重要的角色。初步揭示水环境中细菌间的共 凝集作用也是通过凝集素与糖或糖蛋白等受体的结合进行的。 国外已有共凝集菌与降解菌混合促进生物强化效果的研究报导，在苯酚废水 的生物强化处理中【4 5 】，无苯酚降解能力但有共凝集特性的菌株c o m a m o n a ss p p g 0 8 与苯酚降解菌p r o p i o n i f e l a x 1 i k ep g 0 2 混合投加序批式反应器，促进了苯酚 的降解效率的提高和好氧颗粒污泥的形成。 但有广泛共凝集能力的架桥细菌与多种降解菌混合，探索架桥细菌促进降解 菌定殖于生物膜的研究国内外还未见报道。在生物强化处理中，将降解菌和架桥 细菌混合投加，以架桥细菌为桥梁，通过其共凝集能力将投加的降解菌组合进生 物膜，这将是更趋近自然、更简便的微生物固定化方式。 3 2 1 2 鞭毛和纤毛 研究表明，鞭毛可以促使细菌吸附到基质的表面，并且可以增强细菌在固液 9 第一章综述废水处理系统生物膜中细菌的共凝集 界面的运动能力，而这两点均可能与生物膜的最初形成有关。近年采用细菌运动 能力丧失或瘫痪的基因突变菌株研究鞭毛与生物膜形成的关系，如e c d 疗一般以周 生鞭毛运动，对编码鞭毛蛋白的f c 基因的插入突变【4 6 】，从而导致导致鞭毛的运动 能力丧失，在生物膜的形成初级阶段，与野生型菌株相比鞭毛的缺失突变株严重 阻碍了生物膜的形成。 另外，鞭毛还可能通过以下过程参与了生物膜的形成：鞭毛介导的趋化运动 可以使浮游细菌向着营养物质的方向或者产生信号的生物膜表面运动；鞭毛介导 的运动能在生物膜的播散期促使细菌个体从生物膜表面播散出去等。 3 2 1 3e p s 胞外多聚物是由多糖、蛋白质以及核酸等物质组成，是在生物膜形成过程中 基因表达调控产生的，它是生物膜的重要组成部分，并在生物膜形成的过程中参 与了细菌的黏附，胞外多聚物的异质性还决定了生物膜内部通道的形成，从而影 响水分、营养物质的运输，其量的多少和生物膜结构有重要的关系【2 2 1 。如果对已 形成的生物膜进行处理，瓦解其e p s ，会降低生物膜的复杂程度，并且严重影响细 菌对抗生素的敏感程度。 3 2 1 4 群体感应信号分子 群体感应是细菌根据细胞密度变化进行基因表达调控的一种生理行为。在细 菌完成了附着期后，细菌群体感应机制就在生物膜的形成中如生长期、播散期发 挥重要作用。细菌细胞通过群体感应与周围的环境进行信息交流，从而改变其生 理活性，如共生、细菌毒性、运动性、孢子及生物膜的形成等。有研究表明，缺 失a h l 信号分子的突变株形成了扁平、致密、均质的生物膜，而野生型菌株则形 成了结构复杂，异质的生物膜【4 7 】。如果在突变株细菌生物膜生长的过程中加入a h l 分子，则该细菌可以恢复形成成熟的生物膜。 3 2 2 生物膜形成过程中非生物因素的影响 3 2 2 1 营养 营养成份对于生物膜的形成起重要作用，虽然铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌 几乎可以在任何条件下形成生物膜，但大部分细菌，如大肠杆菌k 2 和霍乱弧菌的 一些菌株在贫营养的条件下就不能形成生物膜。研究指出，单菌种和双菌种生物 膜都会随着有毒代谓j 物( p c r e s 0 1 ) 的水平而改变形态，因此膜基质的构造对培养 1 0 废水处理系统生物膜中细菌的共凝集 第一章综述 基的依赖性很强【4 引。任何特殊体系的基质成分和构造都受包括培养基和代谢物在 内的生理决定物的影响。立n k o l e n b r a n d e r 等人【4 9 】证明，培养基中适当的增加蔗糖的 含量会产生更密更厚的生物膜。 3 2 2 2 水剪切力 有流体存在的情况下，剪切力是生物膜形态的决定性因素之一，水剪切力能 够维持生物膜的厚度和密度的平衡，如强剪切力可以导致薄而致密的生物膜的形 成【5 0 1 。在一个水几乎是静止的容器中，淡水多样生物膜中的聚合要比高剪切力条 件下的有序地多，大量单细胞明显的附着，使生物膜形成更为复杂的结构。高剪 切力条件下的生物膜容易适应选择性压力，形成的生物膜比低流速下的更牢固的 粘附在基质表面。在流速快的河流和川溪中，未聚合的生物体将被从最合适的生 态龛位冲走，生物膜易于形成单层结构【5 1 1 。 3 2 2 3 基底的粗糙程度 微生物最初黏附在暴露于水体中的的基质表面，很大程度上还受到基底、固 体表面与活性溶液以及细菌表面的物理化学相互作用的控制，而不是完全取决于 生物过程。如在海洋系统中，细菌与基底之间的物理接触控制了细菌在其表面的 群居。经过暴露于美国o a h u 南海岸海水中3 天之后，在1 1 类基底上，细菌的富 集随基底湿度的二次函数形式变化【5 2 1 。另外，水温、p h 等非生物因素也在一定程 度上影响生物膜的形成及生物膜的复杂程度。 4 生物膜法污水处理 2 0 世纪以来，大量人工合成化合物被排放进入环境，实践中人们发现，利用 生物的方法，尤其是微生物来处理环境污染问题比很多化学物理的方法更加经济 有效【5 3 1 。但由于污染物其本身结构的复杂性和生物陌生性，很难在短时间内被微 生物利用进入物质循环。这些污染物的治理就给传统的生物处理技术提出了挑战， 由此，人们将起源于农业的生物强化方法于2 0 世纪7 0 年代中期引入环境治理领域 当中，以达到对这些污染物进行去除的目的【5 4 1 。生物强化技术是指为提高处理系 统的处理能力，向该污染治理体系中投加菌种从而实现对目标污染物的高效去除 的方法，其中选用的菌种可以是从自然界中筛选的优势菌种，也可以是通过基因 工程技术得到的有降解能力的基因工程菌。投加菌一般是通过直接生物降解作用、 糖( e p s ) 增多，这说明在整个过程中e p s 可能与生物膜参与金属离子的富集有关。 赵玉清等人【6 1 】在不同浓度铅离子条件下培养生物膜，然后分析不同菌群的生长量， 判断菌群对铅离子的耐受性。生物膜菌群活菌量随铅浓度的增加而减少，存活菌 群较原生物膜菌群对铅具有更强的抗性。挑选吸附性强的菌群扩大培养并对生物 膜进行驯化。经过两次驯化后，对于吸附铅的能力从5 2 8 升高至1 j 9 3 5 。其抗性 随铅浓度的增加而增强，随驯化的次数增加而增大。具有抗性的生物膜菌群对铅 的吸附能力与驯化的次数和菌群扩大培养的效果有关，调整这些因素可增强其对 铅的吸附能力，也可以增强生物膜菌群在铅污染过程中的自调和自净机制。生物 膜在重金属和放射性物质的去除实验中也显示出良好的效果。菌群通过分泌一些 1 2 废水处理系统生物膜中细菌的共凝集第一章综述 物质，在接触面上形成生物膜，由于膜内生物量高和可以使化合物固定不动的能 力，通过生物吸附，生物积累和生物沉淀等作用，降解去除环境中的一些重金属 和放射性物质。 4 3 生物膜在水体脱氮中的应用进展 生物膜反应器在废水处理系统中的应用已有较长时间，但大多对生物膜中的 菌体组成和结构未予过多关注，而只注重最终效果，随着各种新技术和设备的采 用，尤其是分子生物学技术的应用，对废水( 气) 的脱氮相关生物膜技术的研究获得 了新的进展。目前，国内外研究硝化反硝化菌群，主要通过荧光原位杂( f l u o r e s c e n c e i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 、1 6 sr r n a 鉴定等分子生物学手段。并利用微电极检测、 激光共聚焦显微镜( c o n f o c a l s c a n n i n gl a s e rm i c r o s c o p y ) 、荧光显微镜等设备。使硝化 反硝化菌群的很多信息参数可以详细的呈现出来。比如菌群的结构分布特点、菌 体种类、数量、空间分布和生物膜的厚度形状等。这些结果对于我们认识脱氮菌 群，生物膜以及其在环境中的运用都有很大的理论意义和实际应用价值。 4 4 生物膜法污水处理的实际应用 生物膜污水处理方法的发展已有一段时间的历史。发展前期，生物膜反应器 的生物滤池填料主要是碎石，沙土，煤渣等实心的天然材料，这些材料与污水的 接触面积小，彼此又容易靠近，更加减少了与污水的接触面积，发展过程中，人 们广泛使用由聚乙烯、聚苯乙烯和聚酰胺等化学材料制成的蜂窝状、波纹管状等 合成填料，其体积与表面积比显著提高，大大增加了与污水的接触面积。近年来， 除了普通的生物滤池外，淹没式生物滤池、生物转盘、生物流化等技术都得到了 大力发展，此外还有各种独具特点的微孔膜生物反应器、气提式生物膜反应器、 复合式活性污泥生物膜反应器等技术应用到各种不同的污水处理领域。由此可见， 生物膜反应器发展迅速，由单一到复合，由好氧到兼性，逐步形成了一套较为完 整的污水生物处理工艺技术【2 】。 5 本研究的目的和意义 生物膜法应用于污水处理领域虽然由来已久，并且有很多其它污水处理方法 无法比拟的优点，如：经济，占地少，处理效果好等，但仍然存在很多问题。如 不同细菌组合进生物膜的能力不同，降解效果好的细菌往往不具有强成膜能力， 废水处理系统生物膜中细菌的共凝集 进生物膜，或者仅存在于生物膜的表面，无法在高抗性的污水系 研究表明，共凝集能力是影响生物膜形成的一个重要因素。本研 的机制上入手，通过各种方法，从污水处理系统中分离筛选具有 的细菌，进而研究它们与降解菌共同培养时的成膜能力，以期发 膜能力，并且能够强烈的把降解菌整合进生物膜的架桥细菌。这 桥细菌来源于污水处理系统，所以首先能够适应污水中的复杂生 本非常低。另外，能够将共培养的降解菌整合进生物膜，提高降 之在生物膜污水处理系统中长期定植，降低成本。 1 4 废水处理系统生物膜中细菌的共凝集第二章生物膜中细菌的分离 第二章生物膜中细菌的分离 1 生物膜菌的筛选 1 1 材料 1 1 1 培养基 培养基配方： l b 培养基 1 2l b 培养基 蛋白胨 1 0g5g 酵母粉 5g2 5g n a c l1 0g5g 琼脂粉 1 5g1 5g 加一级水定容至1l 。调p h 至7 0 7 4 。 1 1 0 l b 培养基 1g 0 5g 1g 1 5g r 2 a 培养基：酵母粉0 5 9 ，胰蛋白胨0 2 5 9 ，蛋白胨0 7 5 9 ，葡萄糖0 5 9 ，淀 粉0 5 9 ，磷酸氢二钾0 3 9 ，硫酸镁0 0 2 4 9 ，丙酮酸钠0 3 9 ，琼脂1 5 o g 。加一级水 定容至1l 。调p h 至7 0 7 4 。 煮沸分装至三角瓶中高压蒸汽灭菌2 0m i n 后保存。用时微波炉煮沸，于超净 工作台中，酒精灯火焰旁，分装至灭过菌的培养皿中，约2 0m l 个。冷却后待用。 1 1 2 菌种 将2 串工业用填料放置于苏州市某污水处理厂污水处理池中进行生物膜培养， 经3 0 天培养待填料上长出较厚的生物膜后，采集填料，放入无菌三角瓶中用无菌 生理盐水洗下生物膜表面的浮游细菌，然后刮取生物膜，用无菌的生理盐水制成 菌悬液，菌悬液经系列稀释( 用无菌生理盐水稀释至1 1 0 、1 1 0 0 、1 1 0 0 0 浓度) 后分别涂布于l b 、1 2 l b 、1 1 0l b 、及r 2 a 培养基平板进行培养。 1 1 3 实验仪器 超净工作台 光照培养箱 8 0 超低温冰箱 苏净集团安泰公司 广东省医疗器械厂 日本三洋电器公司 第二章生物膜中细菌的分离废水处理系统生物膜中细菌的共凝集 冰箱苏州三星电子 高压蒸汽灭菌锅上海华线医用核子仪器有限公司 鼓风电热恒温干燥箱南京第医疗器械厂 无菌培养皿，无菌试管，酒精灯，接种环。 1 2 方法 不同浓度的菌悬液接种在不同浓度的培养基平板上后放置入3 0 恒温培养箱 中培养2 4h 。超净工作台紫外灭菌1 5m i n ，在超净台中选取生长良好，并且菌落 特征明显不同的菌苔，( 如：颜色、大小、厚薄、湿润度、边缘整齐度等) 用标 记笔标记，在酒精灯火焰旁用灼烧过的无菌接种环画线接种至无菌的l b 平板上， 然后放置入3 0 恒温的培养箱中培养2 4h 。反复转接纯化培养3 次左右，至菌落 明显为单菌落为止。最后选定菌落特点各不相同的1 4 株菌株。分别命名为：g 3 、 g 5 、g 6 、n 2 、q 2 、1 1 、1 2 、f