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最新分子生物学实验技术梁国栋著科学出版社出版索书号：58.178/2分类号：022692内容介绍：本书着重介绍国际上近年发展起来的分子生物学及生物技术方面的新技术、新方法，突出一个“新”字。书中大部分章节是目前国际上的研究热点。如：DNA与蛋白质相互关系、抗体工程、噬体表面显示技术、蛋白质与蛋白质相互关系等。本书对一些有过介绍的，如基因文库构建及筛选，聚合酶链反应(PCR)、DNA测序、基因表达等一些基本实验方法也做了叙述。使本书成为一本较为全面的介绍分子生物学最新实验方法的参考书。因此本书即是一本实用性极强的介绍新技术、新方法的实验手册。也是一本统揽当今分子生物学新理论、新进展的参考书。本书可供分子生物学、生物化学、生物技术、医药卫生以及农、林、牧等方面有关的科研、教学与技术人员参考之用。本书目录：序前言第1章 DNA与蛋白质相互关系1.1细胞核蛋白质的提取1.1.1细胞核蛋白质的提取1.1.2细胞核提取物的快速制备法1.2凝胶滞后实验1.2.1凝胶滞后实验1.2.2超级凝胶电泳1.3干扰实验1.3.1甲基化干扰实验1.3.2尿嘧啶干扰实验1.4脱氧核糖核酸酶足迹分析1.5随机PCR1.5.1寡核苷酸的设计与合成1.5.2寡核苷酸的纯化1.5.3探针标记1.5.4凝胶滞后实验纯化探针1.5.5特异结合序列的克隆与序列分析1.6核酸-蛋白质杂交实验1.6.1电泳及电转移1.6.2标记探针1.6.3蛋白质变性、复性1.6.4杂交及放射自显影参考文献第2章 cDNA文库构建及目的基因的筛选2.1cDNA第一条链的合成2.1.1cDNA第一条链合成的策略2.1.2cDNA第一条链合成的操作步骤2.2cDNA第二条链的合成2.2.1置换合成法2.2.2PCR法2.3cDNA克隆的其他策略2.3.1加尾载体作引物引导cDNA合成定向克隆2.3.2Okayama-Berg克隆法定向克隆2.3.3末端加尾直接克隆非定向克隆2.3.4加接头直接克隆非定向克隆（双链cDNA末端无酶切位点）2.3.5加接头克隆定向克隆（双链cDNA一端带酶切位点）2.3.6加连接于克隆非定向克隆（双链cDNA末端无酶切位点）2.3.7加连接子克隆定向克隆（双链cDNA一个末端带有酶切位点）2.3.8PCR产物的直接克隆非定向克隆2.3.9PCR产物的黏瑞克隆法定向克隆（两个PCR引物均带酶切位点）2.3.10无连接酶克隆法2.4重组子的筛选与鉴定2.4.1根据遗传表型筛选2.4.2分析重组子结构特征的筛选法2.5构建cDNA文库新方法2.5.1减数cDNA文库2.5.2标准化cDNA文库2.6mRNA差示显示技术2.6.1基本原理和方法2.6.2优化反应条件2.6.3差异显示技术在生物医学中的应用2.6.4差异显示技术存在的问题及改良措施2.6.5差异显示技术与相关方法的比较2.6.6差异显示技术的展望2.7人类基因组计划及后基因组计划2.7.1物理图谱的制作2.7.2测序及寻找新的功能因子2.7.3人类后基因组计划参考文献第3章 抗体工程3.1基因工程抗体的免疫学基础3.1.1免疫应答3.1.2抗体的分子结构和功能3.1.3抗体基因的DNA重排3.1.4抗体库的产生3.1.5抗原抗体的结合3.2噬菌体表面表达技术与噬菌体抗体3.2.1表达Fab段抗体的pComb3载体系统3.2.2表达scFv单链抗体pHEN1和pCANTAB5E的载体系统3.2.3抗体基因在大肠杆菌中的转录和翻译3.2.4Fab抗体或scFv抗体在细胞膜间隙的组装3.2.5用于噬菌体抗体表达系统的大肠杆菌菌株3.3基因工程重组抗体Fab抗体3.3.1淋巴细胞的分离纯化3.3.2总细胞RNA的提取3.3.3cDNA的合成3.3.4PCR扩增Fab抗体基因3.3.5PCR产物的纯化3.3.6Fd和轻链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立3.3.7噬菌体抗体库的富集筛选3.3.8噬菌体抗体库的菌落筛选法3.3.9Fab抗体在原核细胞中的可溶性表达3.3.10电转感受态菌XILBlu的制备3.3.11电转感受态菌TG1的制备3.3.12辅助噬菌体毒种制备3.3.13噬菌体毒种的滴定3.4基因工程重组抗体单链抗体scFv3.4.1淋巴细胞的分离纯化3.4.2总细胞RNA的提取和cDNA的合成3.4.3PCR扩增抗体可变区基因及scFV单链抗体基因3.4.4Linker连接片段的制备3.4.5人单链Fv（scFv）片段的组装3.4.6scFv单链噬菌体抗体库的构建3.4.7单链噬菌体抗体库的富集筛选3.4.8scFv单链抗体融合表达和可溶性表达3.5Fab段抗体和scFv单链抗体表达产物的纯化和鉴定3.5.1抗Fab抗体亲和层析纯化法3.5.2Protein A-Sepharose柱层析纯化3.5.3金属离子亲和层析柱纯化3.5.4Fab抗体或scFV抗体的特异性鉴定3.5.5重组抗体可变区基因序列测定及分析3.6重组抗体全免疫球蛋白基因的表达3.6.1可变区基因与恒定区基因的连接全抗体基因在哺乳类细胞中的表达3.6.2全IgG抗体基因的表达系统重组杆状病毒系统参考文献第4章 丝状噬菌体表面显示技术的基本原理和应用4.1概述4.1.1丝状噬菌体的基本特征4.1.2噬菌体显示的基本原理和优势4.1.3噬菌体显示技术的发展和意义4.1.4噬菌体显示的基本策略4.2噬菌体随机多肽文库4.2.1概述4.2.2构建噬菌体肽库的操作步骤4.3噬菌体在cDNA文库表达和筛选中的应用4.3.1pJuFo载体的概述4.3.2pJufo载体应用举例4.3.3pJuFo系统的筛选4.3.4pJuFo系统的应用4.3.5pJuFo系统优势和限制因素4.4噬菌体在蛋白质改造中的应用4.4.1选择突变蛋白质的一般原则4.4.2实验设计的一般步骤和程序4.5影响噬菌体筛选效率的因素4.5.1表达水平对筛选效率的影响4.5.2亲和力对筛选效率的影响4.6噬菌体表面显示技术相关的信息资源4.6.1噬菌体肽库和抗体库4.6.2抗噬菌体抗体4.6.3如何分析筛选结果4.6.4分子文库的www网址参考文献第5章 聚合酶链反应5.1基本PCR技术5.1.1基本步骤5.1.2实验条件的优化5.2RTPCR5.2.1基本步骤5.2.2简化步骤5.2.3影响因素5.3单侧（锚式）PCR5.3.1扩增已知序列的下游片段5.3.2扩增已知序列的上游片段5.3.3注意事项5.4差异显示PCR5.4.1实验步骤5.4.2注意事项5.5免疫PCR5.5.1实验步骤5.5.2注意事项5.6PCRELISA5.6.1实验步骤5.6.2注意事项参考文献第6章 实用DNA突变技术6.1无表型选择的寡核苷酸介导的突变6.1.1突变原理6.1.2实验操作步骤6.1.3注意事项6.2简并寡核苷酸诱变6.2.1突变原理6.2.2实验操作步骤6.2.3注意事项6.3基因人工合成6.3.1突变原理6.3.2实验操作步骤6.3.3注意事项6.4区域特异性突变6.4.1突变原理6.4.2实验操作步骤6.4.3注意事项6.5DNA的接头分区突变6.5.1突变原理6.5.2使用巢式缺失的互补寡核苷酸的接头分区突变(基本方案)6.5.3使用寡核苷酸定位的接头分区突变（替代方案）6.5.4注意事项6.6PCR介导的突变6.6.1通过PCR方法引入限制性酶切位点原理（基本方案1）6.6.2实验操作步骤6.6.3通过PCR方法引入点突变原理（基本方案2）6.6.4实验操作步骤6.6.5通过连续PCR引入点突变原理（替代方案）6.6.6实验操作步骤6.6.7注意事项参考文献第7章 外源基因在哺乳动物细胞中的表达7.1外源基因导入哺乳动物细胞中的技术方法7.1.1磷酸钙沉淀转染法7.1.2DEAE-葡聚糖转染法7.1.3脂质体介导的转染7.1.4电穿孔转染法7.1.5基因枪粒子轰击法7.1.6受体介导的基因导入法7.2病毒载体介导的基因转移7.2.1通过反转录病毒系统表达外源基因的原理7.2.2建立特异的产反转录病毒细胞系（基本方法）7.2.3通过腺病毒载体系统表达外源基因7.3报告基因的表达及检测7.3.1半乳糖苷酶基因7.3.2下氯霉素乙酸转移酶基因7.3.3荧光素酶基因7.3.4绿色荧光蛋白基因7.3.5人生长激素基因7.3.6分泌型的碱性磷酸酶基因7.3.7-葡萄糖醛酸酶基因7.4外源基因的稳定表达7.4.1保留稳定转化细胞系的常用选择标记7.4.2分离稳定转化细胞系的基本步骤（基本方法）参考文献第8章 DNA序列测定8.1DNA测序方法概述8.1.1DNA测序方法的分类8.1.2DNA测序的策略8.1.3双脱氧测序法和化学测序法的选择8.1.4DNA测序技术的进展8.2构建DNA测序用的嵌套缺失8.2.1用外切酶（Exo）构建单一方向的缺失（基本操作）8.2.2用-35SdNTPs保护DNA使其免受外切酶（Exo）的消化8.2.3用Bal31核酸酶构建嵌套缺失（基本操作）8.2.4制备M13mp测序载体来亚克隆Bal31消化的DNA片段8.2.5注释8.3DNA序列测定模板的制备8.3.1单链M13噬菌体DNA的制备8.3.2从小量细胞裂解液中制备DNA模板8.3.3化学测序所需重组Psp64CS或pSP65CS质粒DNA的微量制备8.3.4双脱氧法测序所需双链质粒DNA的微量制备8.3.5双脱氧法测序所需双链质粒DNA的碱变性8.3.6从一个大肠杆菌菌落中制备质粒DNA或从一个噬菌斑中制备噬菌体DNA用于热循环测序8.3.7注释8.4DNA双脱氧测序法8.4.1用测序酶（Sequenase）来标记终止测序反应（基本操作）8.4.2在标记终止反应中使用Mn2+离子（替代操作1）8.4.3在标记终止测序反应中使用其他DNA聚合酶（替代操作2）8.4.4用Klenow片段进行Sanger法测序（基本操作）8.4.5利用Taq DNA聚合酶进行Sanger反应（替代操作）8.4.6利用5末端标记引物进行一步法测序（替代操作2）8.4.7利用同位素标记核苷酸进行热循环测序反应（基本操作）8.4.8利用5端引物标记进行热循环测序反应（替代操作）8.4.9注释8.5用化学发光检测法进行DNA双脱氧测序8.5.1用生物素化引物进行化学发光检测的DNA测序（基本操作）8.5.2用链霉抗生物素蛋白和生物素化碱性磷酸酶进行两步（间接）检测（替代操作1）8.5.3用半抗原标记引物进行测序，用抗体-碱性磷酸酶偶联物进行检测（替代操作2）8.5.4注释8.6化学法测定DNA序列8.6.1策略设计8.6.2用32P标记DNA的化学测序（基本操作）8.6.3Tth111I消化和末端标记（替代操作）8.6.4注释8.7变性凝胶测定电泳8.7.1灌胶、电泳和测序凝胶的处理（基本操作）8.7.2缓冲液梯度测序凝胶（替代操作1）8.7.3电解质梯度测序凝胶（替代操作2）8.7.4含甲酰胺的测序凝胶（替代操作3）8.7.5注释参考文献第9章 蛋白质的表达9.1外源基因在原核细胞中的表达9.1.1蛋白质在原核细胞中的表达特点9.1.2蛋白质在原核细胞表达的调控9.1.3蛋白质在原核细胞中的表达形式9.1.4T7启动子的原核表达系统9.1.5利用pET载体在大肠杆菌中表达外源基因的基本操作9.2外源基因在哺乳动物细胞内的表达9.2.1病毒介导的基因表达9.2.2重组痘苗病毒共表达汉坦病毒M和S片断的操作步骤9.2.3外源基因在哺乳动物细胞中的瞬时表达9.2.4痘菌病毒瞬时表达T7 RNA聚合酶的操作步骤9.2.5外源基因在哺乳动物细胞系中的稳定表达9.2.6哺乳动物细胞系稳定表达汉坦病毒S片断的操作步骤9.3外源基因在杆状病毒系统的表达9.3.1杆状病毒系统表达外源基因的特点和策略9.3.2杆状病毒表达汉坦病毒M片断的操作步骤9.4重组蛋白的检测和鉴定9.4.1免疫荧光（IFA）的原理和基本操作9.4.2酶联免疫吸附试验9.4.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本操作9.4.4蛋白印迹试验的基本操作9.4.5放射免疫沉淀的原理和基本操作参考文献第10章 蛋白质与蛋白质相互作用的研究策略10.1蛋白质间相互作用的形式和作用力10.1.1蛋白质间相互作用的形式10.1.2蛋白质之间相互作用的作用力10.2蛋白质间相互作用的研究策略10.2.1蛋白质配体结合结构域的筛选10.2.2蛋白质配体的筛选10.3酵母双杂交系统的操作程序10.3.1酵母双杂交系统操作的基本流程10.3.2实验材料10.3.3基本实验方法10.4注释参考文献第11章 生物芯片技术11.1生物芯片技术的发展11.2生物芯片的类型11.2.1基因芯片11.2.2蛋白芯片11.2.3缩微芯片11.3生物芯片应用的大致操作流程11.3.1探针的设计、合成与芯片的制作11.3.2靶基因样品的制备11.3.3杂交11.3.4杂交信号的检测与结果的分析11.4生物芯片应用的具体操作方法11.4.1cDNA微点阵11.4.2寡核苷酸微点阵11.5生物芯片技术的应用11.5.1利用DNA芯片进行DNA序列的测定11.5.2利用芯片技术进行基因突变的检测11.5.3用于基因转录水平的监测、基因组分析和后基因组研究11.6前景与展望参考文献第12章 生物信息学12.1概述12.2生物信息数据库与查询12.2.1基因和基因组数据库12.2.2蛋白质数据库12.2.3功能数据