质谱技术(mass spectrometry, MS)是一种依据质荷比之.doc

Mass Spectrometry質譜儀的發展起源質譜儀(mass spectrometry, MS)是以熱電子撞擊氣體分子，使產生碎片及離子，再經磁場分離，依據質荷比之測量，來決定分子質量的技術。而質量是分子的一種特質，因此可以用於分子的鑑定或確認。1912年湯姆遜(J. J Thomason)用以發現質量數為22氖之同位素之陽極射線管乃質譜儀之前身。1919年阿斯頓(Aston)與丹麥斯特(Dempster)分別發展曲形軌道質譜儀成功。1943年美國加州統一工程中心製成第一部商業質譜儀售予大西洋煉油公司以作分析石油成分之用。隨著電子技術發展，質譜儀製造日益精確完備，不但成為化學分析之必備工具，而且廣泛應用於核子物理，生物醫藥，以及地質冶金，環境科學等如能降低製造成本，簡化操作技術，其發展將更不可限量。1基本原理(1).將不同型態的樣品氣、液、固相導入質譜儀。(2).樣品分子在離子源內游離(ionization)成氣相之離子形式。(3).依質荷比(m/z : mass to charge ratio)不同分離各個樣品離子。(4).各樣品離子到達偵測器被偵測出來。(5).在資料處理系統中，離子偵測訊號被轉換成可讀或圖譜方式呈現。2V * B = F Ion veloutyB 磁場方面F 作用力之方向M3+ M2+ M1+ (分子量越大移動距離越遠)M+M3+M2+M1+Fig1.表示帶電物質再電場中移動的距離和分子量的大小成正比。m = atomic molecular weightB = 磁場強度e = chargeV = voltager = radius & curvaturem / z = B2r2e / 2Vm / z = k * r2在本公式中，Z值通常表示1，所以m值和 r2成正比關係。質譜儀的基本構造式樣儲供離子產生離子分析離子測量電子控制系統真空系統樣本處理方式質譜儀分析時，樣品必須先進行離子化，因樣品其物理、化學性質不同，而有各種不同離子化方式，一般易揮發性樣品則用電子撞擊游離法(electron impact ionization, EI)，或化學游離法(chemical ionization, CI)。 非揮發性樣品，則用快速原子撞擊(Fast atom bombardment, FAB)，或電灑法(electron spray ionization, ESI)等。因此各種樣品選擇適當的離子化法，再經質譜分析，即可進行樣品之結構性分析級定量分析測定。3經由質譜儀之分析可得到各種有價值的樣品訊息：2(1).元素分析。(2).化學結構的決定。(3).直接精確的分子質量測定。(4).混合物中各組成的分析。質譜儀的種類氣相層析質譜儀Gas Chromatography/Mass Spectrometer (GS/MS)氣相層析質譜儀實際上是由兩部功能不同的儀器組成：其一為氣相層析儀，是將混合物分離為純物質的設備。這一種技術，近年來發展迅速，其使用領域遍及工業，研究及學術界。說起來，氣相層析的原理很簡單，是利用各種成分在一種固定的液相及一種流動的氣相中，分配率的不同，而達到分離的效果。靜止的液相通常是塗抹在固體的支持物上，將待測樣品注射入氣體流，各成分以不同流速通過塗有液體的支持物，由於各成分蒸汽壓不同，與液體產生的作也不同，所以離開管柱的時間也不一樣，因是得以分離。假設將氣相層析儀的裝置連接質譜儀，則各成分都可測定出其分子量和結構。因為在質譜儀的游離室中，樣品受電子照射，於是，化合物即產生裂訊、游離，帶正電荷的碎片或離子，經電場加速、磁場轉彎，可得一質譜圖。7液相層析質譜儀Liquid Chromatograph/Mass Spectrometer(LC/MS)LC/MS是Liquid Chromatograph/Mass Spectrometer (液相層析儀質譜儀)的縮寫，是將液相層析儀(LC)和質譜儀(MS)串聯使用的特殊組合。簡單的說，LC是質譜儀上游的檢體輸入器，而MS則是液相層析儀下游的產物檢測器。使用LC/MS時，我們只需將檢體送入液相層析儀，LC優越的分離純化能力，便會把檢體內複雜的成分，按著時間一一送出。層析儀流出的產物，隨即導入質譜儀作進一步的檢測。由於無須收集處理LC析出的成分，一則節省了許多耗力費時的繁複步驟，二則避免了處理樣品時所造成的無謂流失。而質譜儀的基本功能，在於測量各個成分的質量以及它們的相對含量。現今配備較齊全的質譜儀，更具有分析其分子結構的能力。判讀時，機器會將受檢測的分子作有限度的擊碎；由於分子破碎時，有各自特定的模式，經由解讀這些碎片“指紋”，可以推知原先分子的結構。綜合LC與MS的優點，無需對成分複雜的檢體作太多的處理，我們便可以在種類、數量甚至分子結構上，得到非常有用的資訊。質譜儀可以藉由解讀分子的碎片“指紋”，而推知它碎裂前的結構。當然，這原理也可以直接應用在分析蛋白質的結構。不過在送入機器前，我們通常必須先用蛋白酵素處理蛋白質，將它轉成機器能夠分析的Peptides。經過質譜儀的誘發，這些Peptides會循著一定的模式碎裂，機器並隨即記錄下此碎片質譜，聯結的電腦資料庫可協助來判讀質譜。5四極柱式質譜儀Quadrupole Mass Spectrometer 四極柱式質譜儀的裝置示意如圖所示，其主要由四支圓柱形的電極棒所組成，以四方形之對角線形成雙曲線之排列，電極棒的中央形成一個靜電場。其中相對的電極棒以電線連接，將直流電壓(dc)與射頻電壓(rf)通入其上。Y軸方向的一對電極所加入之直流電壓為負電；X軸方向的一對電極所加入之直流電壓為正電，且射頻電壓與Y軸的相位相差180度。這些直流電壓為正電，且射頻電壓所形成的電場使得離子在其中產生一定規則之振動軌跡，在某一固定的施加電位下，只有某一個質荷比(m/e)的離子呈穩定振動並通過四極圓柱而到達SEM並被偵測到，其他質荷比之離子則因軌道振幅越來越大而撞擊到四極柱上而被中和。 不同質量之離子在電場中的解析能力(Mass Resolution)，決定於施加在電極柱上dc與rf電壓的比值，固定保持dc與rf電壓的比值，並同時改變dc與rf的電壓，則可改變穿過的m/e值的大小，而使不同質量的離子被偵測到，故四極柱式質譜儀亦可稱為質量過濾器(Mass Filter)。因快速改變dc和rf的電壓，使得四極柱式質譜儀能在微秒的間距中很快地做質量掃描。這種特性非常適合用以偵測TDS進行溫度變化時熱脫附定性及半定量的真實時間掃描。 由四極柱質譜儀濾出之離子最後進入偵測系統。本偵測系統由17個分開的電極所構成，電極材料為Cu-Be所組成。當一個正離子打在第一個電極時會激發出23個二次電子，而每個被激發的電子又會撞擊下一個電極而放出23個二次電子，所以一個離子經SEM (Secondary Electron Multiplier)後可放出217317個電子，第一個電極可單獨偵測到入射離子的強度而得到放大因子(Amplification Factor)。最後將這些收集到的電訊號經資料處理介面轉換成電腦可辨視的數據，而完成整個量測的過程。6質譜儀在蛋白質體學研究上的應用在生命科學研究中，有極大部分的努力是用於天然或合成之生物分子結構之決定，而質譜儀式達成此目的不可或缺的工具之一。在蛋白質的研究：傳統上決定完整蛋白質分子的質量，多是使用SDS-PAGE技術得到的約略分子量，其質量正確性極少優於5%，而使用silver staining的偵測極限也在1-5ng之間。現在利用MALDI-TOF MS已可作低pmol至fmol樣品量之分析，質量正確性優於0.05%，而理論上質量範圍並無限制。由於蛋白質是由二十種胺基酸分子以不同數目及排序聚合而成的這個特性，用某些特定蛋白質分解酵素(如胰蛋白脢Trypsin)可以將蛋白質分子中某些特定胺基酸(如Arginine及Lysine)分解，使每一個蛋白質被切割成為一群獨特的、大小不同、質量不一的胺基酸片段。將這一群胺基酸片段的質量數目組合，舉例來說有六個胺基酸片段，其質量分別為474、587、652、883、921 及1034，對於原來未被切割的完整蛋白質分子而言，就如同指紋對於每一個人一樣，具有獨特性，重覆的機會非常小。在基因資料庫越來越完備的情況下，幾乎每一個基因所製造出來的蛋白質胺基酸序列，及其被胰蛋白脢切割成所形成胺基酸片段的質量數目組合，皆可以利用生物資訊學發展出的分析軟體加以預測。因此，在二維電泳膠片上所分離之上千種蛋白質，可以分別取出並利用胰蛋白脢切割成胺基酸片段，接著送入質譜儀分析這些胺基酸片段的各別質量。質量決定出來後，直接將這些質量數目組合輸入資料庫(胰蛋白脢切割所有已知蛋白質成所形成胺基酸片段的質量數目組合資料庫)內比對，立刻可以得知蛋白質的身份。高靈敏度生物質譜儀的高解析能力與高效率，大大加速了蛋白質體學的研究腳步。42002諾貝爾化學獎 鑒於質譜儀與核磁共振儀已成為現今研究蛋白質結構不可或缺的利器，2002年諾貝爾化學獎的榮耀，理所當然的落在為這領域帶來突破性發展的人士即美國學者約翰芬恩（John B. Fenn）、日本研發工程師田中耕一（Koichi Tanaka），及瑞士籍研究教授伍斯瑞許（Kurt Wuthrich）以表彰他們對於鑑定蛋白質大分子結構的貢獻。其中再質譜儀的貢獻上是由美國學者約翰芬恩（John B. Fenn）、日本研發工程師田中耕一（Koichi Tanaka）共同獲得這項榮譽。質譜儀分析蛋白質組成的突破性發展質譜儀的結構主要可分為五大部分，包括樣品導入系統、離子源、質量分析器、偵測器及數據處理系統。質譜儀能分析的樣本分子的大小及樣本分離效率，主要是由離子源決定，芬恩與田中耕一的貢獻，即在於質譜儀游離源的研發與突破，使質譜儀分析大分子物質的功能與效率大為提昇。早期質譜儀的應用主要侷限於較小的化學分子之定性及定量，主要是因為在一開始進行質譜分析時，必須先將化合物轉換成氣態離子，而傳統上多使用加熱的方式將分析物氣化後再離子化。以加熱的方式處理高極性的分子，易發生熱裂解的現象，而一般生化因子多為高極性，並不適合進行分析。為了克服極性分子熱烈解現象所帶來的限制，所謂的快速原子撞擊法（fast atom bombardment；FAB）應孕而生，此法是英國的巴柏教授所開發出來，原理上是先將分析物溶於適當的介質中，再使用高能的原子撞擊樣品，便可有效的解決高極性分子離子化的過程。然而，此法仍有分析物分子量的限制，一般分子量超過3000amu的分子，離子化的效率將下降非常快，蛋白質多為分子量一萬以上的大分子，仍無法以質譜儀加以分析。（1） 八年代中，電漿脫附法（plasma desorption ）的出現，將譜儀能分析的分子量提升到了4,5000，使蛋白質進行質譜分析成為可能。此法主要是使用不穩定元素鉲252裂解後所產生的高能粒子，撞擊配製於硝化纖維中的生化分子，使之產生離子化現象。但欲以此法得到一張質譜圖，往往需要幾個小時或更長的時間，效率上及能分析的分子量提昇上都仍需加以改良。 一九八八年，兩種新而有效的離子化方法幾乎同一個時間被開發出來，即芬恩教授所提供的電灑法（eletro-spray ionozation；ESI ），及田中耕一所開發的基質輔助雷射脫附法（matrix assisted laser desorption ioniztion；MALDI）。電灑法芬恩於一九一七年在美國紐約市出生，一九四年畢業於耶魯大學，一九九四年任維吉尼亞聯邦大學教授（2）。於一九八四年首度發表了以電灑的方式作為離子化的方法，目的在於提供一個能和液相層析結合的質譜介面；但一直到一九八八年首度發表了使用此技術分析蛋白質的數據後，電灑法才廣泛的受到世人的注意。電灑法主要是利用將所欲分析的樣本溶液，由一個前端施以高電壓的毛細管噴灑而出，由於流經毛細管出口時受到電場作用，噴出的液滴會攜帶電荷。帶電荷液滴最終形成電荷的氣相離子，便可送至質譜儀的質量分析系統加以偵測。解釋帶電荷液滴形成氣相離子的過程的理論主要有二，一為電荷殘留理論（1968，M. Dole），另一為離子揮發理論（1976, B. A. Thamson）。多數的研究者認為電荷殘留的理論解釋較合理，此理論認為氣相離子的形成是由於原帶電荷液滴的溶劑揮發後，電荷殘留於原液滴中所包含的大分子溶質，而形成氣相離子。而一九九三年，芬恩則把離子揮發理論加以改良，用來解釋大分子帶多電荷的現象，其原因在於一開始液滴中帶有多個電荷，而且這些電荷也同時被帶有異性電荷的離子所包圍；由於大分子在液滴中的布朗運動而移動到液滴表面，此時大分子便會取代數個位於液滴表面的電荷，再藉由熱能的驅動使大分子的一部份帶電區域自液滴表面突出，一但突破能障後，分子便與液滴脫離而形成帶有多價電荷的離子（如圖一）（2）。溶劑揮發電荷殘留A液珠分裂溶劑揮發氣相離子B溶劑揮發氣相離子電荷取代突破能障分子布朗運動至液滴表面圖一：帶電荷液滴離子化過程理論。A，電荷殘留理論；B，1993年芬恩修正的離子揮發理論。電灑法最終可使同一分析物在氣相化的過程中接上不同數目的質子，而攜帶不同的電荷，經由質譜儀進一步的分析，便可到一系列有關該分子質荷比（m/z）的圖譜，雖然這使得電灑法的圖譜變得較為複雜，但相對的提供了更多的譜峰資訊，有助於經由資料庫比對圖譜，使蛋白質鑑定的工作變得較為容易。使用電灑法分析蛋白質觀測到的典型質譜圖如圖一。由圖二A可知，一個蛋白質在質譜圖中出現了相當多的質譜峰，這些質譜峰是由於同一分析物帶不同電荷，而形成的不同質荷比（m/z）所造成。由於每個分子攜帶多電荷所形成的不同質荷比分布有一定的特性，因此將A的結果經過簡單的轉換後，便可得蛋白質正確的質量（圖二B）。圖二：（A）馬心臟肌紅素之電灑法質普圖，B14至B22代表所帶電荷數；（B）馬心臟肌紅素經轉換後之電灑法質譜圖。（圖片來源：參考資料1）電灑法為現今游離方式中最溫和的一種，且可保持蛋白分子離子化過程中結構的完整性，並可利用多重價電荷的方式偵測巨大生化分子，而擴大了一般質譜儀所能偵測的範圍，這是其他游離法無法做到的。此外，電灑法尚提供了一個方便和其他液相層析方式（如高效能液相層析儀(HPLC)、毛細管電泳儀(CE)）結合的介面，使生化分子的研究更為方便容易。 介質輔助雷射脫附法介質輔助雷射脫附法，主要是由傳統的雷射脫附法（LD）改良而來。傳統的雷射脫附法於一九六年代就已被提出，一九七八年波薩瑪斯（M. A. Posthumus）等人就加以應用於核苷酸、胺基酸、醣類等較小的生化分子的研究，其方法是將高能量的雷射光束照射在固體表面上，可從表面脫付出完整的離子，再以質譜儀加以分析。由於雷射的能量很高，易將欲分析的化合物打成許多的離子碎片，而使得質譜圖上出現較多的雜訊，若將分子量較大的樣本加以分析，會因雜訊的干擾過大，而無法進行分析。傳統的LD離子化的質量上限不超過1000。 田中耕一於一九五九年在日本富士山出生，得到日本東北大學的電器工程學士後，便到島津製作所任職，縣為該公司技術步的主任。一九八七年時，田中耕一於一項學術會議中首度展示了以雷射脫附技術，成功地分析一完整的蛋白質分子的圖譜，對以LD為基礎的離子脫附技術，用以分析大分子量的物質，帶來重大的突破。一九八八年介質輔助雷射脫附技術（MALDI）正式被引進。MALDI與傳統LD分析上最大的不同處在於離子化時樣本處理的方式，MALDI在離子化前，會先將分析樣本，與小分子量的有機分子（具有高度吸收雷射能量特性）基質加以混合，然將大約1l的樣品基質混合物點至於平滑的樣品金屬表面上，待其乾燥形成固體結晶後，放於質譜儀之離子源中施以雷射脈衝，基質變可將所吸收的能量轉移給樣本分子，使之游離為氣相狀態並轉變為離子（3）。由於基質的輔助，可將需要離子化大蛋白的雷射能量降低，可有效避免先前因雷射源太強使得欲分析的樣本斷為多個片段，而使雜訊過大的困擾。 其實MALDI技術的研發，另一為科學家海倫坎普（Franz Hillenkamp）也功不可沒。他與田中耕一分別於一九八八年提出MALDI技術，而現今所改良的MALDI技術，皆以海倫坎普所提出的為主流。海倫坎普主要是使用無害的小分子有機酸作基質，樣品的製備過程較為簡單迅速；除此，他也做過許多關於MALDI相關的演講，也寫過許多回顧性的文章，可以說是公認的MALDI專家。因此美國質譜儀學會曾於1997年頒給他傑出貢獻獎。 而海倫坎普未得到此次諾貝爾化學獎，跌破了許多專家的眼鏡。其真正原因諾貝爾獎委員會並未提出明白說明，可能原因皆來自於外界的臆測。除了田中耕一早先於1987年便發表了以MALDI為依據的相關成果外，海倫凱普之後的文