毕业论文正文规范.doc

内蒙古农业大学生物工程学院本科毕业论文(设计) 第18页引 言青贮是利用微生物的发酵作用，长期保存青绿多汁饲料营养特性，扩大饲料来源的一种简单、可靠而经济的方法，是保证家畜常年均衡供应青绿多汁饲料，调剂淡季青饲料丰欠，合理利用青饲料的一项有效方法。优质的青贮饲料色泽黄绿且有光泽，气味酸香、柔软多汁，是家畜越冬度春不可缺少的优良饲源。青贮饲料不添加任何动物源添加剂，具有安全可靠、生产条件便利等特殊优点。青贮饲料在微生物发酵过程中产生的乳酸、醋酸及醇类具有酒香味，所以它适口性好，且易消化吸收。从青贮的发酵机理分析10，青贮饲料发酵过程是乳酸菌及多种微生物大量繁殖的过程。如何使其更快地产生乳酸及挥发性脂肪酸（VFA），促进多糖与粗纤维的转化，抑制丁酸的产生，有效提高青贮饲料的品质，是近30年来世界上青贮技术研究的热点。青贮的全过程就是复杂的微生物发酵和生物化学反应的过程，是各类微生物兴衰变化的结果。参与作用的微生物很多，但以乳酸菌为主，青贮饲料调制的成败，主要决定于乳酸生成的过程，其产生越充分，青贮的品质就越好。乳酸菌具有较强的耐酸能力，在青饲料发酵过程中，同型发酵乳酸菌，如植物乳杆菌和短乳杆菌是在乳杆菌中最先出现，在青贮饲料中占有优势。其次能分解糖的梭菌，如丁酸梭菌或酪丁酸梭菌较其它梭菌更耐酸，它们可驱动后发酵，促使丁酸生成，丁酸是青贮变质的一种重要形式。芬兰生物化学家彼尔塔耐（“AIV法”发明者），研究发现甲酸的存在对青贮饲料发酵非常有益，甲酸的存在可以迅速降低pH值，从而促进乳酸菌的繁殖，抑制有害菌的增殖，获得优质青贮。综上所述，监控青贮发酵不同时期各酸的组成，是研究青贮饲料发酵工艺和评价青贮品质的重要技术。脂肪酸和乳酸也作为饲料的主要酸味剂被广泛使用6。它们不仅具有抑制霉菌等有害微生物增殖的作用，而且可减少动物胃肠道中有害微生物的繁殖，同时可降低饲料pH值，激活消化酶，有助于消化吸收某些营养物质，提高饲料转化率，以及为动物提供能量等功能。由于这些酸被完全代谢，并安全无毒而被许多国家批准用于动物饲料的日粮。因此乳酸和挥发性脂肪酸（VFA）的含量及组成是判断相关饲料品质的重要指标之一，所以精确测定乳酸和挥发性脂肪酸（VFA）是饲料检验中一项不可缺少的重要分析技术。目前国内外测定乳酸和挥发性脂肪酸主要是采用气相色谱法9，一般方法是乳酸和挥发性脂肪酸分别测定，青贮饲料中的乳酸和挥发性脂肪酸的同时测定未见报道。青贮饲料是多种微生物同时发酵，干扰物质多，分析测定难度大。所以探索一种快速简便且能同时测定青贮饲料中乳酸及挥发性脂肪酸含量的技术有着非常高的实用价值。目前普遍采用直接进样或苄酯化法和乙酯化法处理白酒、饮料和蔬菜等样品，前者分离效果差，乳酸峰拖尾严重，后者酯化试剂毒性大。我们参考了众多资料应用的实验技术并加以改进，采用简便的甲酯衍生化方法，利用气相色谱填充柱，探索出一种能同时快速测定青贮饲料中的乳酸和挥发性脂肪酸（VFA）的方法。为青贮饲料的研究提供可靠的分析技术，并可以为有机酸发酵产品的分析测定提供参考。实 验 部 分1、实验材料与试剂配制1.1 实 验 材 料1.1.1 试 剂 甲酸、乙酸、正丁酸、乳酸为分析纯，丙酸、正戊酸、异戊酸 为化学纯。丙酮、二甲基甲酰胺、四甲基氢氧化铵、碘甲烷均为分析纯。1.1.2 待测样品 内蒙古农业大学生态学院送来检验的青贮饲料，样1为高活性6g,玉米1kg ； 样2为高活性4g,玉米1kg；样3为盛夏1.5g,玉米1kg；样4为水分70%,玉米1kg。1.1.3 仪 器 日本岛津GC9A型气相色谱仪，氢火焰离子化检测器1.1.4 色谱条件色 谱 柱：柱长2m，内径3mm，不锈钢柱固 定 相：15%的邻苯二甲酸二壬酯与5%的吐温80混合固定液，担体Chromosorb HP （80100 mesh）。温 度：柱温100 ,检测器温度：150 。气体流速：载气（氮气），30ml/min；氢气，50ml/min；空气，500ml/min灵 敏 度：102进 样 量：1l 纸 速：2mm/min1.2 试剂配制1.2.1 标准溶液的配制标准酸溶液的配制：取甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、异戊酸、乳酸试剂适量，分别用蒸馏水稀释至20ml，待标定。 标准氢氧化钠溶液的配制：取50% 的氢氧化钠水溶液 8.0g 于 1000 ml 容量瓶中定容，待标定。标准邻苯二甲酸氢钾标定液的配制：取适量邻苯二甲酸氢钾置于110烘箱23 h,放入干燥器冷却至室温，准确称取0.5g（精确至0.0001g），加入50ml煮沸冷却后的蒸馏水做标准标定液。四甲基氢氧化铵溶液的配制：取10g 25%的四甲基氢氧化铵溶液于100ml容量瓶中定容，此溶液浓度约为0.29mol/L，备用。1.2.2 各标准溶液的标定 氢氧化钠溶液的标定用邻苯二甲酸氢钾标准标定液，以酚酞为指示剂，对氢氧化钠溶液进行标定，标定结果见表1.1。 表1.1 氢氧化钠溶液的标定结果标定次数邻苯二甲酸氢钾质量（g）氢氧化钠溶液消耗量（ml）氢氧化钠溶液摩尔浓度（mol/L）氢氧化钠溶液平均浓度（mol/L）10.504226.000.095060.095020.509926.500.0943230.500625.700.09548氢氧化钠溶液浓度（mol/L）=式中：M-邻苯二甲酸氢钾的质量（g）V-滴定消耗氢氧化钠溶液的体积（ml） 204邻苯二甲酸氢钾的分子量 各标准酸储备液的标定取各标准酸储备液2.0ml，加蒸馏水4ml，用已标定好的氢氧化钠溶液进行滴定，结果见表1.2。表1.2 标定各酸消耗标准氢氧化钠溶液体积(ml)甲酸乙酸丙酸丁酸戊酸异戊酸乳酸消耗量111.308.907.205.714.654.286.54消耗量211.358.757.055.604.554.286.50平均值11.3258.8257.1255.6554.6004.2806.520标准酸储备液浓度(mol/L)=式中：V滴定消耗氢氧化钠溶液的体积（ml） 0.0950氢氧化钠溶液的浓度（mol/L） 2取标准酸储备液的体积（ml）根据上述公式计算出各储备酸溶液的浓度，结果见表1.3表1.3 各标准酸储备液浓度组分浓度甲酸乙酸丙酸丁酸戊酸异戊酸乳酸摩尔浓度（mol/L）0.53790.41920.33840.26860.21850.20330.3097分 子 量46.0360.0574.0888.11102.14102.1490.03质量浓度（mg/ml）24.7625.1725.0723.6722.3220.7727.881.2.3 标准酸混合液的配制 配制标准酸中间溶液分别取各标准酸储备液：甲酸1.0ml，乙酸1.0ml，丙酸0.5ml，丁酸0.5ml，戊酸0.3ml，异戊酸0.3ml，乳酸2.5ml置于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀待用。 标准酸混合使用液的配制取标准酸中间溶液4.0ml于10ml的容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀待用。2、测定方法与测定结果2.1 标准酸甲酯衍生物的制备准确取制备好的标准酸混合使用液1.0ml置于蒸发皿中，加入0.5ml丙酮，立即用四甲基氢氧化铵溶液小心地中和至pH值为8.59.0（记录溶液消耗体积），中和后的溶液在沸水浴上蒸干，冷却至室温，加入2.0ml二甲基甲酰胺，充分溶解后置于具塞试管中，加入上述中和滴定时所消耗四甲基氢氧化铵摩尔数1.1倍的碘甲烷，塞紧，充分振荡，室温下静置30min以上，取上层清液上机测定。碘甲烷的加入量(l)=式中：141.97碘甲烷的分子量2.3碘甲烷的密度（g/ml）M四甲基氢氧化铵溶液的浓度V中和滴定时所消耗四甲基氢氧化铵的体积K蒸干后溶液残渣的稀释倍数1.1碘甲烷加入量为理论值的1.1倍（为确保甲酯化反应完全）2.2 色谱定性分析按上述方法分别制备各个标准酸单个组分的甲酯试样，上机测定，以各酸的保留时间定性。色谱定性分析结果见表2.1。表2.1 挥发性脂肪酸及乳酸的色谱定性分析结果组分名称甲酸乙酸丙酸丁酸戊酸异戊酸乳酸保留时间（min）1.502.323.956.9713.899.7316.142.3 各酸标准曲线的绘制 从各标准酸储备液中取甲酸5.0ml，乙酸4.0ml，丙酸和丁酸各1.5ml，戊酸和异戊酸各1.0ml，乳酸10ml，置于25ml容量瓶中，用蒸馏水定容，为号标准液；在号标准液中取2.0ml置于5ml容量瓶中定容，为号标准液；在号标准液中取1.0ml置于5ml容量瓶中定容，为号标准液；在号标准液中取1.0ml置于10ml容量瓶中定容，为号标准液；在号标准液中取1.0ml置于25ml容量瓶中定容，为号标准液。各标准酸浓度见表2.2。表2.2 绘制标准曲线的各酸浓度（mg/100ml）样号甲酸乙酸丙酸丁酸戊酸异戊酸乳酸529.11393.63150.96139.3786.3683.451054.15211.64157.4560.3855.7534.5433.38421.66105.8278.7330.1927.8717.2716.69210.8352.9139.3615.1013.948.648.35105.4221.1615.756.045.573.453.3442.17将上述号标准酸溶液甲酯化后上机测定，各酸标准曲线及线性方程如下。 y = 0.1094x + 8.54r = 0.96050102030405060700.00200.00400.00600.00浓度（mg/100ml）峰面积图2.1 甲酸标准曲线y = 0.3523x + 4.825r= 0.99930204060801001201401600200400600浓度（mg/100ml）峰面积图2.2 乙酸标准曲线y = 0.4808x + 0.1984r= 0.999801020304050607080050100150200浓度（mg/100ml）峰面积图2.3 丙酸标准曲线y = 0.5615x + 0.7446r= 0.9996020406080100050100150浓度（mg/100ml）峰面积图2.4 正丁酸标准曲线y = 0.598x + 0.1573r= 0.99870102030405060050100浓度（mg/100ml）峰面积图2.5 戊酸标准曲线y = 0.6191x + 0.2979r= 0.99950102030405060050100浓度（mg/100ml）峰面积图2.6 异戊酸标准曲线y = 0.302x + 1.7208r= 0.9995050100150200250300350050010001500浓度（mg/100ml）峰面积图2.7 乳酸标准曲线图2.8 标准酸色谱图A.碘甲烷 B.二甲基甲酰胺 1.甲酸 2.乙酸 3.丙酸4.正丁酸 5.异戊酸 6.正戊酸 7.乳酸2.4 方法精密度测定取标准酸混合使用液0.5ml和空白草浸提液1ml于蒸发皿中，按标准酸甲酯衍生物的制备方法制备测试样。平行制备6份测定，测定结果见表2.3。表2.3 各酸含量测定结果（mg）及变异系数组分123456标准偏差变异系数（）甲酸0.6570.5320.6400.6630.6970.0639.8乙酸0.4530.4890.4960.4850.5180.4890.0214.2丙酸0.2280.2230.2310.2190.2350.2240.0062.6丁酸0.2190.2130.2210.2120.2280.2150.0062.7异戊酸0.1180.1080.1160.1070.1250.1110.0076.0戊酸0.1310.1200.1170.1320.1290.1160.0075.8乳酸1.2471.2141.2141.1941.3111.2310.0413.32.5 各酸回收率的测定取标准酸混合使用液0.5ml和空白草溶液1ml于蒸发皿中，按标准酸甲酯衍生物的制备方法制备试样。平行制备6份测定，各酸回收率的测定结果见表2.4。 表2.4 各酸回收率的测定结果加入量(mg)应测量(mg)实际测得量(mg)平均回收率（）123456甲酸0.4950.4950.6570.5320.6400.5180.663121.5乙酸0.5030.5030.4530.4890.4960.4850.5180.48997.0丙酸0.2510.2510.2280.2230.2310.2190.2350.22490.4丁酸0.2370.2370.2190.2130.2210.2120.2280.21592.0异戊酸0.1250.1250.1180.1080.1160.1070.1250.11191.7戊酸0.1340.1340.1310.1120.1170.1320.1290.11692.7乳酸1.3941.3941.2651.2321.2321.2121.3291.24989.9图2.9 空白样色谱图A. 碘甲烷 B.二甲基甲酰胺 1.甲酸2.6 青贮饲料中挥发性脂肪酸及乳酸的测定2.6.1 青贮饲料前处理流程：青贮饲料 粉碎浸泡 离心取上清液 取1ml于蒸发皿中 用四甲基氢氧化铵滴定至pH值8-9 沸水浴蒸干 用2ml二甲基甲酰胺溶解 置于具塞试管中加碘甲烷 30min后取上清液上机测定。测定结果见表2.5。图2.10 青贮饲料样品色谱图A.碘甲烷 B.二甲基甲酰胺 C杂质峰 1.甲酸 2.乙酸 3.丙酸 4.正丁酸 7.乳酸表2.5 青贮饲料中挥发性脂肪酸及乳酸含量测定结果（mg/100g）组分 样号样1样2样3样4甲酸160.81117.8180.14139.05乙酸291.26341.14745.52848.04丙酸1.072.694.745.22丁酸7.2450.1524.6331.78戊酸异戊酸乳酸668.03943.952923.302999.302.6.2 样品分析精密度实验 选择饲料样品2按上述方法平行制备4份样品，测定分析变异系数结果见表2.6。表2.6 青贮饲料样品测定的精密度组分测定结果(mg/100g)标准偏差变异系数（）1234平均值甲酸117.81107.54120.29122.54117.056.625.6乙酸341.14332.70342.23305.78330.4616.995.1丙酸2.692.972.942.772.840.134.5丁酸50.1549.7752.8052.0451.191.462.8异戊酸戊酸乳酸943.95933.42976.64931.47946.3720.912.22.7 最低检出限测定 将青贮饲料样4的浸提液分别稀释4倍、5倍、10倍、20倍后按标准溶液酯化方法酯化后测定，分析结果如表2.7。表2.7 各酸最低检出浓度（mg/100g）组份甲酸乙酸丙酸丁酸戊酸异戊酸乳酸最低检出 限9.226.192.561.5415.103、讨论3.1 分析方法的探索1、在实验初期我们采用苄酯化的方法，利用SE-31填充柱和DEGS填充柱在多种色谱条件下，包括程序升温进行试验，但最终没有将各酸有效分离。且苄酯化试剂溴化苄有强烈的催泪作用，苄酯化过程需要2小时以上才能充分酯化。2、采用直接进样的方法分析，不能分离甲酸，且乳酸峰脱尾现象严重。3、我们采用甲酯化的方法，曾用二甲基乙酰胺作为溶解季胺盐的溶剂，也能达到有效的分离效果，但是它的保留时间在1小时以上，分析速度慢。最终选择了极性稍弱的二甲基甲酰胺做溶剂，达到了满意的分离效果，且它的保留时间仅为26min，大大提高了分析速度。4、确定采用甲酯化的前处理方法后柱温的选择：我们选用的固定相最高使用温度为150，实验表明，在柱温低于100时色谱柱的选择性改善不大，柱效显著下降，高于120对甲酸的准确性会有更大的影响。在100时难分离物质对乙酸和碘甲烷仍能定量分离，故本实验选择的柱温为100恒温分析。最终本实验采用甲酯衍生物制备方法，柱温100的条件下，各酸的甲酯衍生物在15%的邻苯二甲酸二壬酯与5%的吐温80混合固定相上获得了满意的分离结果。且前处理操作简便，分析周期短，定量结果准确。3.2 四甲基氢氧化铵的用量为了保证样品中挥发性脂肪酸及乳酸完全生成季胺盐，所以在用四甲基氢氧化铵中和各酸时要过量，稍过量的四甲基氢氧化铵会在以后的蒸发过程中被分解成甲醇和三甲胺除去，对酯生成反应没有影响。但是四甲基氢氧化铵用量会关系到碘甲烷的用量，所以不能过量太多，实验表明四甲基氢氧化铵用量以滴定pH值在8.59之间为宜。3.3 碘甲烷的用量实验证明，控制四甲基氢氧化铵滴定pH值在8.59之间，碘甲烷的用量为中和滴定时所消耗四甲基氢氧化铵摩尔数的1.1倍，这样可以使酯化反应完全。因为碘甲烷的色谱峰与乙酸的色谱峰靠近，为了使两组分能够定量分离，要严格控制碘甲烷的用量。3.4 样品测定结果讨论1、从空白样测定结果可以看出在整个色谱分析体系里（包括上机样的溶剂、酯化试剂等）含有与甲酸保留行为相似的物质，所以在空白样中出现甲酸峰。这也是导致甲酸回收率高于100的原因。2、测定分析的4份青贮饲料中甲酸、乙酸和乳酸含量较高，丁酸的含量相对比较低，证明此青贮工艺良好，均达到了获得优质饲料的目的。3、比较4份青贮饲料中挥发性脂肪酸及乳酸的测定结果，我们可以看出样4的发酵工艺是比较成功的，它发酵产生乳酸高达2999.30mg/100g，同时乙酸产量为848.04 mg/100g，也处于较高水平。但是丁酸含量为31.78 mg/100g，高于样1的丁酸含量7.24 mg/100g，因此样4的发酵条件仍需进一步改善。我们通过比较样品中挥发性脂肪酸及乳酸含量，再结合微生物作用机理，可使青饲料的贮存、发酵技术进一步优化。 结 论1、实验结果表明此研究方法回收率高，精密度好，适合青贮饲料和其它发酵液中挥发性脂肪酸及乳酸的测定。2、该方法解决了甲酸甲酯衍生物沸点低、在色谱柱上的保留时间太小导致定性定量测定困难的问题，一次同时测定了包括甲酸在内的7种有机酸。与其它方法比较，该方法快速、准确、简单、且成本低，适合批量样品测定,具有很强的实用价值。3、该方法的不足之处在于甲酸的回收率较高，变异系数较大，甲酸的定量结果是否准确有待于进一步研究。致 谢本实验是在田瑞华老师的精心指导下完成的。在大学即将毕业的时候，田老师耐心、严谨、孜孜不倦的精神深深地感染了我，让我在完成毕业设计实验期间不仅学到了很多专业上的知识，也让我在为人处事上受益匪浅。在田老师的悉心指导下我充实而愉快的度过了大学里最后的学习阶段，并且顺利地完成了毕业论文的撰写。