第八章 发酵工艺的控制.doc

发酵工艺过程，不同于化学反应过程，它既涉及生物细胞的生长、生理和繁殖等生命过程，又涉及生物细胞分泌的各种酶所催化的生化反应过程。发酵工程是生物应用工程学科，是微生物学在工业生产领域的大规模应用，是化学工程在生物技术领域的延伸，是生物、化学和工程等学科的综合利用。8.1发酵过程的主要控制参数1. 物理参数（1）温度（）直接影响发酵过程的酶反应速率，氧的溶解度和传递速率，菌体生长速率和合成速率。（2）压力（Pa）影响发酵过程氧和CO2的溶解度，正压防止外界杂菌污染。罐压一般控制在0.21050.5105 Pa。（3）搅拌速度（r/min）搅拌器在发酵过程中的转动速度。其大小影响发酵过程氧的传递速率，受醪液的流变学性质影响，还受发酵罐的容积限制（见下表）发酵罐容积(L)搅拌转速范（r/min）备注32002000实验室研究101501000实验室，小试50100800中试20050400中试或生产1000025200生产5000025160生产（4）搅拌功率（kW）搅拌器搅拌时所消耗的功率（kW/m3），在发酵过程中的转动速度。其大小与液相体积氧传递系数有关。（5）空气流量（m3空气/（m3发酵液min）单位时间内单位体积发酵液里通入空气的体积，一般控制在0.51.0（m3空气/（m3发酵液min）（6）粘度（Pas）细胞生长或细胞形态的一种标志，反映发酵罐中的菌丝分裂情况，表示菌体的浓度。（7）浊度（）反映应单细胞生长情况（8）料液流量（L/min）进料参数（6）粘度（Pas）细胞生长或细胞形态的一种标志，反映发酵罐中的菌丝分裂情况，表示菌体的浓度。（7）浊度（）反映应单细胞生长情况（8）料液流量（L/min）进料参数（3）溶解氧浓度（ppm或饱和度，）溶解氧是好氧发酵的必备条件，是生化产能反应的最终电子受体，也是细胞及产物重要的组分。通常用饱和百分度表示。（4）氧化还原电位（mV）培养基的氧化还原电位是影响微生物生长及生化活性的因素之一。在某些限氧发酵（如氨基酸），氧电极以不能精确使用，氧化还原电位参数控制较为理想。（5）产物浓度（g（u）/ml）检验发酵是否正常与否的重要参数，是决定发酵周期长短的根据.（6）废气中的氧浓度（Pa）废气中的氧浓度与发酵微生物的摄氧率和KLa有关，以此确定发的供氧能力。（7）废气中的CO2浓度（%）根据废气中的氧浓度和CO2浓度，以此计算产生菌的呼吸商，了解产生菌的呼吸代谢规律。3. 生物参数（1）菌丝形态菌丝形态是衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一。（2）菌体浓度菌体浓度是控制微生物发酵的重要参数之一。生产上，常常根据菌体浓度来决定补料量和供氧量，以保证生产达到预期水平。根据菌体浓度研究菌体比生长率，基质比消耗率等动力学参数，以此确定最佳发酵工艺。8.2发酵过程中的代谢变化代谢变化反映了菌体生长、发酵参数和产物生成速度的关系。Gaden把微生物发酵过程分为三种类型： 型，生长产物合成偶联型：微生物的生长和糖的利用与产物合成直接相关连，产物的形成与生长是平行的，产物合成速度与微生物生长速度呈线性关系，而且生长与营养物的消耗成准定量关系。产物直接来源于产能的初级代谢。如酒精、葡萄糖酸、乳酸发酵就属于此类型型，生长产物合成半偶联类型：产物的合成来自次级代谢，存在着与生长相联和不相联两个部分，先是基质消耗和菌体生长高峰，后是菌体进入生长静止期，出现产物形成高峰。如柠檬酸、谷氨酸、赖氨酸、依康酸、丙酮、丁醇发酵型，生产与产物合成非偶联类型：菌体生长和产物合成完全分开的，如各种抗生素和微生物毒素等物质的生产速率很难与生长相联系。产物合成速度与碳源利用也不存在定量关系。产物的合成是在菌体的浓度达到最高之后才开始的，如青霉素、链霉素、核黄素、糖化酶的发酵。型，生长产物合成偶联型： 型，生长产物合成半偶联类型：型，生产与产物合成非偶联类型：1. 初级代谢的代谢变化初级代谢是生物细胞在生命活动中进行的代谢活动，初级代谢产物是菌体生长繁殖所必需的。初级代谢菌体生长过程呈现延滞期、对数期、静止期和死亡期。除对数期的微生物外，其他时期的微生物作为发酵种子均会出现延滞期。延滞期的长短还会受菌体的生理状态和发酵条件的影响。初级代谢型发酵产物与菌体生长成平行关系；型发酵产物受基质成分、温度、溶氧、菌株影响较大。下面以谷氨酸发酵威力加以说明型发酵产物乳酸的生长速率与产物的比生产速率Qp几乎同时达到峰值。型发酵产物谷氨酸生长速率比产物的比生产速率Qp几稍快些。2. 次级代谢产物的代谢变化次级代谢产物包括大多数抗生素、生物碱、微生物毒素等属于型发酵，即生产与产物合成非偶联类型。发酵分为完全分开的菌体生长阶段，产物合成阶段，和菌体自溶三个阶段。（1）菌体生长阶段（发酵前期或平衡期）碳源和氮源等进行分解代谢，基质不断被消耗，菌体不断繁殖，菌浓不断增加；菌体摄氧率增加，溶解氧浓度下降，菌体达到临界浓度时，氧浓度达最小；pH发生一些变化，或先升后降，或先降后升；发酵体系出现某一限制因子，菌体生长速率下降，中间代谢产物大量积累；菌体生理发生变化，与次级代谢相关的酶被解除控制，菌体进入产物合成阶段。（2）产物合成阶段（分泌期或发酵中期）发酵过程中代谢变化如下：菌体达到临界浓度，菌体基本不繁殖，但细胞内含物仍在增加，菌体干重增加；总DNA含量达定值；基质继续被消耗，产物不断被合成，代谢仍然包括基质的分解代谢和产物合成代谢；但菌体的呼吸强度不变环境条件对产物合成很敏感，需严加控制温度，pH/，基质浓度和溶解氧浓度；基质浓度不能过高或过低，过高则会引起菌体繁殖，过低会加速菌体老化；（3）菌体自溶阶段（自溶期或发酵后期）发酵过程中代谢变化如下：菌体细胞衰老，细胞开始自溶；氨氮含量增加，pH上升；产物合成能力衰退，生产速率下降；发酵一旦进入自溶阶段必须结束，否则产物会被破坏，还会给后续工艺带来困难。8.3菌体浓度的影响及其控制菌体细胞浓度（cell concentration）是指单位体积醪液中菌体的含量，反映菌体细胞的多少、菌体的分化阶段，与菌体的生长速率有密切关系。1. 影响菌浓的因素（1）微生物种类菌体的繁殖速率与微生物的自身遗传特性有关，取决于细胞结构的复杂性和生长机制。典型的细菌、酵母、霉菌和原生动物的倍增时间为：细菌45分钟酵母90分钟霉菌3小时原生动物6小时（2）基质浓度由Monod关系式 得出，生长速率取决于基质浓度。当基质浓度S10Ks时，比生长速率就接近最大值。基质抑制效应：所有营养物质均存在一个上限浓度，在此限度内，菌体的比生长速率随浓度增加而增加，但超过此浓度，浓度继续增加会引起生长速率下降的现象（可能时基质浓度过高，形成高渗透压，引起细胞脱水而抑制微生物生长）。一些营养物质的上限浓度为：NH4+5g/L ，PO43- 10g/L，葡萄糖 100g/L （3）其他环境条件温度pH值渗透压水分活度2. 菌浓对发酵的影响（1） 对代谢产物得率的影响初级代谢发酵产物与菌浓成正比关系，Rp=QpmX，如氨基酸、维生素，菌浓越大，产率越高；（2）对溶解氧的影响菌浓越大，能提高摄氧率（OUR），使摄氧率按比例增加（OURQO2X），菌浓越大，表观粘度增加，降低氧传递速率（OTR），使溶解氧减少。3. 菌浓的控制控制基质浓度，调节基质组成；中间不料控制（补加磷酸盐提高菌浓）。8.4基质的影响及其控制基质即培养微生物的营养物质，供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质混合物。基质的种类和浓度与发酵代谢有着密切关系，控制基质的种类和浓度是提高代谢产物的重要方法。1. 碳源的种类和浓度快速利用碳源能迅速参与代谢、菌体繁殖、产生能量，并产生分解代谢产物（如丙酮酸），有利于菌体生长。缓慢利用碳源多为聚合物，为菌体缓慢利用，有利于延长产物合成，特别有利于延长抗生素发酵的分泌期，乳糖（青霉素发酵），蔗糖（头孢菌素C发酵），麦芽糖（盐霉素发酵），玉米油（核黄素发酵），半乳糖（生物碱碱发酵）。糖对青霉素生物合成的影响糖的缓慢利用是青霉素合成的关键因素，缓慢滴加葡萄糖可以代替乳糖，这里的乳糖是青霉素合成缓慢利用碳源，并非前体物质。生产实践中，通过动力学研究方法或经验性方法 确定补糖时间，补糖量，补糖方式，提高产率；通常采用速效碳源和缓慢利用碳源混合碳源。 2. 氮源的影响和控制氮源构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质，可补充碳源，是发酵的主要原料之一。也有迅速利用氮源和缓慢利用氮源。缓慢利用氮源：主要为有机氮源，黄豆饼粉，玉米浆，棉籽饼粉，蛋白胨，酵母粉，鱼粉，菌丝体，酒糟。具有延长次级代谢产物分泌期，提高产量的作用。迅速利用氮源：主要为无机氮源，氨水，硫酸铵，氯化铵，硝酸盐，具有调节pH值的作用；速效氮源容易被菌体吸收利用，促进菌体生长，但对产物合成具有调节作用，影响产量。生产上发酵培养基一般选用含有快速和慢速利用混合氮源，如链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉。方法有：（1）补加有机氮源，如尿素，既可做氮源也可做pH调节剂。（2）补加无机氮源，最常用的是氨水和硫酸铵，前者为碱性，后者为生理酸性盐。3. 磷酸盐浓度的影响和控制磷 是构成核酸，蛋白质等细胞物质的组成成分，是许多辅酶和高能磷酸键的成分，氧化磷酸化的必需元素。微生物可生长的磷酸盐浓度为0.32300mmol/L；微生物次级代谢合成最高的磷酸盐浓度为1mmol/L；金霉素炼霉菌四环素发酵最适菌体生长磷浓度6570g/L；最适合成四环素磷浓度2530g/L；青霉素发酵以0.01磷酸二氢钾最佳；另外，其他成分也会影响发酵得率，可根据各菌种生理特性因地制宜的控制。8.5温度的影响及其控制1. 温度的影响（1）影响微生物各种酶催化反应的速度和蛋白质的性质；微生物可生长的温度范围较广，总体说在-1095。在生物学范围内温度每升高10，生长速度通常就加快一倍；温度每升高10酶反应速度增加23倍；菌体生长的酶反应和产物合成酶反应温度往往是不同的，因而发酵过程的温度直接影响产率；金霉素链霉菌四环素发酵时，30一下时金霉素增多，35时只生产四环素；（2）影响发酵液的物理性质如粘度，基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率，基质的分解和吸收速率，进而影响产物合成2.影响发酵温度的因素发酵液的温度变化受生物热、搅拌热 、蒸发热 、辐射热 和显热的影响，用公式表示为Q发酵Q生物+Q搅拌Q蒸发 Q辐射Q显（1）生物热生物热是菌体在生长繁殖过程中产生的热能，来自菌体的分解代谢，生物热的大小域菌种、培养基成分和菌体的呼吸强度有关。培养基愈丰富，生物热愈大；细胞数量愈多，生物热愈大；呼吸强度愈高，生物热愈大。（2） 搅拌热搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量，用公式表示Q搅拌=3600（P/V）P/V是通气条件下单位体积发酵液所消耗的功率（kW/ m3）3600为热功当量（kJ/（ kWh）（3）蒸发热、显热和辐射热空气进入发酵罐，与醪液充分混合，引起水分蒸所需的热能为蒸发热水分蒸发、进气和废气排出因温度差异所带走的部分热能为显热发酵罐外壁与大气间的温度差异使发酵罐中的部分热能通过罐体向大气辐射的热能为辐射热3. 温度的控制（1）最适温度的选择最适发酵温度使既适合菌体生长，有适合代谢产物合成的温度。最适菌体生长温度和最适产物合成的温度往往不一致。如乳酸链霉菌发酵生产乳酸，最适菌体生长温度为34，最适产物合成温度为30；青霉素发酵，产黄青霉最适菌体生长温度为30，最适产物合成温度为24.7；最适发酵温度随菌种、基质成分、培养条件和菌体生长阶段而；理论上讲，发酵过程可以设置不同的发酵温度时段，包括菌体生长发酵温度和产物合成发酵温度等。生产上，由于发酵液体积大，少则几十立方米，多则上百上千立方米，升降温度时间长，难度大，通常采用一个发酵温度。（2） 温度的控制发酵罐在发酵过程中一般不需加热，选用微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，这对生产有很大的好处，即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备，因此培养耐高温的菌种有一定的现实意义。生产中，温度的控制是采用冷却水通入发酵罐的蛇管或夹套中，热交换保持恒温发酵的。8.6 pH的影响及控制（1） pH的影响培养基中的pH值与微生物生命活动有着密切关系，各种微生物有其可以生长的和最适生长和最适生产的pH范围。一般微生物的最适生长pH范围为：细菌：pH7.08.0放线菌：pH7.58.5酵母菌：pH3.86.0霉菌：pH4.05.8藻类：pH6.07.0原生动物：pH6.08.0微生物代谢产物的合成也有最适pH范围为，青霉素合成最适pH为6.56.8。pH对发酵液或代谢产物产生影响，会影响产物的稳定性。 发酵过程中，控制发酵液的pH值是控制生产的指标之一，pH值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。控制pH值不但可以保证微生物良好的生长，而且可以防止杂菌的污染。在发酵工业中，维持适宜的pH已成为生产成败的关键因素之一。 2. pH的变化发酵过程中，pH的变化与菌种、培养基的成分和培养条件有关。微生物通过其活动也能改变环境的pH值，菌体本身具有调节周围pH 的能力。例子：地中海诺卡氏发酵利福霉素SV时，起始pH为6.8及7.5时，最终pH均达7.5，产率正常；起始pH为6.0时，最终pH为4.5，产率为0；培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。若阴离子(如醋酸根、磷酸根)被吸收或氮源被利用后产生NH3 ，则pH上升；阳离子(如NH4、K+ )被吸收或有机酸的积累，使pH下降。一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH转移，这都跟碳氮比直接有关。 3. 发酵pH的确定和控制（1）根据实验确定最佳发酵pH，单因素测试法，正交试验。（2）pH的控制，可考虑培养基成分的生理酸性盐和生理碱性盐的缓冲作用；生产中常用补加酸碱来控制，如氨水，尿素，硫酸铵等。8.7溶氧的影响和控制 1. 溶氧的影响溶氧是需氧发酵控制的重要参数之一，氧的溶解度很小，氧的溶解度仅为6.4mg /L ，只能保证氧化8.3mg葡萄糖，仅相当于常用培养基葡萄糖浓度的1。微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代谢，厌气菌为厌气发酵(分子间呼吸)，兼性厌气菌则两者兼而有之。溶氧大小对菌体生长和产物的性质和产量产生不同影响；例如，谷氨酸发酵时，通气不足会积累大量乳酸和琥珀酸；不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对通风量的要求也不相同。例如，天氡酰胺酶发酵，前期为好气培养，后期为厌氧培养，产酶能力会大大提高。2. 发酵过程的溶氧变化发酵前期（生长期），菌体繁殖迅速，菌体摄氧率增加，醪液粘度上升，需氧量增加，溶氧下降。发酵中期（静止期），需氧量在有所减少，菌体和发酵液粘度均达到峰值；溶氧在较低水平维持一段时间后，开始上升，菌体进入次生代谢物合成期；发酵后期，产物大量合成，呼吸强度比较稳定，溶氧增加，若此时补糖，可降低溶氧，否则，菌体衰老，菌体进入自溶阶段。发酵过程中有时会发生溶氧异常情况（异常下降或升高）异常下降原因可能有：污染好氧菌；或菌体向好氧代谢途径迁移，或供氧设备发生故障等。异常上升原因可能有：污染噬菌体，菌体完全北裂解；或菌体向厌氧代谢途径迁移3. 溶氧的控制溶氧浓度的控制可从供氧和需氧两方面着手，其中供氧时主要的：需氧方面：需氧量手菌体浓度，基质浓度和种类，培养条件有关。供氧方面：提高氧的传递推动力和液相体积氧的传递系数KLa速率；生产中常采用加大通气速率，或提高搅拌转速，或适当增加罐压；通气可以供给大量的氧：通气量与菌种、培养基性质、培养阶段有关。通气量的多少，最好按氧溶解的多少来决定。只有氧溶解的速度大于菌体的吸氧量时，菌体才能正常地生长和合成酶。因此随着菌体繁殖，呼吸增强，必须按菌体的吸氧量加大通气量，以增加溶解氧的量。搅拌则能使新鲜氧气更好地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致，还有利于营养物质和代谢物的分散。此外，挡板则有助于搅拌，发酵液为湍流状态，使其效果更好。罐压方面，一般来说，若培养罐深，搅拌转速大，通气管开孔小或多，气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解速度就大，而且在这些因素确定下，培养基的粘度越小，氧的溶解速度也越大。搅拌可以提高通气效果，但是过度地剧烈搅拌会导致培养液大量涌泡，容易增加杂菌污染的机会，液膜表层的酶容易氧化变性，微生物细胞也不宜剧烈搅拌。8.8二氧化碳的影响及其控制1. 二氧化碳的来源和影响二氧化碳是微生物在生长繁殖过程中的代谢废物，也是某些合成代谢的基质，对微生物生长和发酵具有刺激或抑制作用；（1）二氧化碳效应：一些细菌发芽的孢子在开始生长时，需氧一定浓度二氧化碳才能生长良好的现象，如环状芽孢杆菌（Bacillus circulus，E.coli）（2）二氧化碳抑制作用：例如影响菌丝形态CO2浓度为08时，产黄青霉呈丝状，CO2浓度为1522时，产黄青霉丝粗短，CO2分压为0.08105Pa时，产黄青霉呈球状，合成受阻（3）二氧化碳对细胞的作用机制 CO2及HCO3-影响细胞膜的结构， CO2影响细胞膜的脂质核心部位，影响细胞膜的膜蛋白， HCO3-膜的流动性和表面电荷密度发生改变，基质运输受阻； CO2对降低pH，或发生化学沉淀反应 反馈抑制某些前体物质的合成2. 二氧化碳浓度的控制在相同条件下，二氧化碳的溶解度是氧的30倍，二氧化碳的浓度同样受呼吸强度，发酵液的流变学性质。通气搅拌，外界压力的影响，控制方法可采用加大通气速率，或提高搅拌转速，或适当增加罐压；增加通气速率，可增加溶氧浓度，降低二氧化碳浓度；增加罐压或提高搅拌速率有利于溶氧提高，同时也使二氧化碳浓度增加。8.9补料的作用和控制1. 分批补料培养（fed-batch culture）的优点和应用分批补料培养是先投入一定量底物装入罐内，到发酵过程的适当时期，开始连续补加碳-能源或氮源或其他基质，使发酵过程中，限制性底物浓度在罐内保持一定；发酵液体积达到最大工作体积时，终止发酵，醪液一次全部取出的发酵方法；介于分批发酵与相连续发酵之间的一种发酵技术，在发酵工业中普遍应用。分批补料发酵的优点（1）可以解除底物抑制，产物反馈抑制，分解代谢产物抑制；（2）可避免菌体过量生长，能改善发酵液性质；（3）能有效控制菌浓度，菌体细胞的质量2. 分批补料发酵的补料方式和控制补料方式有单组分补料（限制性因子）和多组分补料；反馈控制系统包括传感器、控制器、驱动器三个单元组成；既可以直接控制限制性因子（碳源、氮源或碳氮比）的浓度，也可以间接控制溶氧、pH、呼吸强度、CO2浓度、产物浓度8.10泡沫的影响和控制1. 泡沫的影响泡沫是发酵醪液中具有表面活性蛋白类表面活性剂物质，在通气条件下形成的。泡沫是一种胶体体系；面上泡沫，分布在醪液上面，气液界面明显，气相比例大；面下泡沫，又称流态泡沫，分布在醪液中，气液界面不明显，体系稳定；泡沫的负面影响：减少发酵罐工作体积，引起醪液逃液；降低溶氧，减少氧传递系数；引起污染，严重时会导致倒罐；2. 泡沫的控制（1）调整培养基成分避免或减少一起泡沫的培养基成分；改善发酵工艺，采用分批补料方法发酵；改变发酵的部分物理化学参数，如温度，pH值，通气和搅拌（2）机械消泡增加消泡装置，内消法和外消法，（3）消沫剂消泡法消泡剂是抑制底表面张力的表面活性剂，天然油脂类：豆油，玉米油，棉籽油，菜子油，猪油等；聚醚类：GP型聚合物（氧化丙烯和甘油聚合物，）；GPE型聚合物（氧化丙烯、环氧乙烷和甘油聚合物，亲水性，泡敌）；硅酮类：高碳醇、脂肪酸和酯类8.11发酵终点的判断1. 发酵过程的优化主要指标有： 产物得率最大（或产量最大）， 生长得率最大， 成本最低， 产品质量最好 经济效益最大等2. 发酵终止时间的确定是以上指标的综合考虑，生产力高成本低利润大为准则确定放罐时间。3. 放罐的指标参数:产物含量，菌丝形态，pH值，醪液的外观色彩，粘度等种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。接种量的大小直接影响发酵周期。大量地接入培养成熟的菌种的优点：1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率，2. 节约了发酵培养的动力消耗，3.并有利于减少染菌机会，一般都将菌种扩大培养，进行两级发酵或三级发酵。接种量和培养物的生长过程的延缓期长短呈反比。接种量过多也无必要。因培养种子费时，而且过多地移人代谢废物，反而会影响正常发酵。 二、菌种扩大培养 工业微生物菌种培养的类型 工业微生物的培养法分为静置培养和通气培养两大类型。 静置培养法即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行发酵，又称为嫌气性发酵。 通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性发酵。在静置和通气培养两类方法中又可分为液体培养和固体培养两大类型，其中每一类型又有表面培养与深层培养之分。 (三）主要培养方法及特点 1种子扩大培养阶段 (1)液体培养法 包括液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养。摇瓶通气量大小与摇瓶机型式、转数、振程(或偏心距)、三角瓶容量、装料量有关。 (2)表面培养法 包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。 (3)固体培养法 包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。2大规模生产阶段 (1)表面培养表面培养是一种好氧静置培养方法针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固态表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液(气固界面向培养基内传递，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。这种培养方法菌的生长速度与培养基深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度也越快。氧的供给常成为发酵的限速因素，所以发酵周期长，占地面积大。优点是不需要深层培养时的搅拌和通气，节省动力。如醋酸、柠檬酸发酵和曲盘制曲。(2)固体培养固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。固体培养具有以下优点： 原料：以谷物和农业废物为主要原料，只需外加适量水分、无机盐等。培养基组成简单。 防止污染：利用霉菌能在水分较低的基质表面进行增殖的特性，在这种条件下，细菌生长不好，因此不易引起细菌污染。 通气：无论浅盘或深层固体通风制曲，可以在曲房周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度，并且能根据菌种在不同生理时期的需要，灵活加以调节。在固体培养中，氧气是由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的用通气搅拌供给氧气节能。 (3)液体深层培养 用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。深层培养基本操作的3个控制点 灭菌：发酵工业要求纯培养，因此在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。所以发酵罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和发酵罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于发酵罐内。 温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行发酵，由于随着微生物的增殖和发酵会发热、搅拌产热等，所以为维持温度恒定，须在夹套中以冷却水循环流过。 通气、搅拌：空气进入发酵罐前先经空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进人，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。搅拌的目的除了溶解氧之外，可使培养液中微生物均匀地分散在发酵罐内，促进热传递，以及为调节pH而使加入的酸和碱均匀分散等。几种深层培养法 放大法两步法控制培养法 分批发酵法(间歇发酵法)连续培养法补料分批培养法(流加法) 放大法： 将微生物在摇瓶基础上逐级放大以实现大规模生产。在厌气发酵时问题归结为如何从大型发酵罐中除去发酵热。为此考虑到如何利用发酵时生成的二氧化碳引起的液体流动和辅助搅拌，以提高冷却效率，这只需进行发酵罐传热面积的设计即可。但在好氧培养中，大多以氧的供给为基准进行放大。一般从实验室规模到工厂生产要经过35级放大步骤。放大过程中应考虑：a氧传递速度相等。b比较搅拌桨叶顶端速度。c比较单位液量所需的搅拌动力。d混合时间相同。e雷诺准数相同。f通过反馈控制尽量能使重要环境因子一致。 两步法：酶制剂生产两步法的特点是将菌体生长条件(营养期)与产酶条件(自我繁殖期)区分开来。菌种先在丰富的培养基上大量繁殖，然后收集菌体浓缩物，洗涤后再转入添加诱导物的产酶培养基，在此期间，菌体积累大量的酶，一般不再繁殖，营养成分或诱导物得到充分利用。 在氨基酸的两步法液体深层培养中，每一步菌种和培养基等均不相同。第一步属有机酸发酵或氨基酸发酵。第二步是在微生物产生的某种酶作用下把第一步的产物转化为所需的氨基酸，这种生产方法又称为酶转化法。 控制培养法 了解发酵罐内部的变化情况，掌握短暂时间内状态变量的变化以及可能测定的环境因子对微生物代谢活动的影响，并以此为基础进行控制培养，以达到产物生成的最优培养条件。用测定状态变量的传感器取得数据，经电子计算机进行综合分析，再将其结果作为反馈调节的信号，将环境(培养条件)控制于给定的基准内。这就叫做电子计算机控制发酵。目前已大量用于露天大罐啤酒发酵。分批发酵法(间歇发酵法) 先将空罐杀菌，培养基装入发酵罐，接种之后进行培养，在培养过程中，培养基成分减少，微生物增殖。微生物周围的环境随时间而变化，是一种非稳态操作法。此法不易染菌，但很难采用控制基质等浓度的方法来增大发酵生产能力。目前多用在酒精、氨基酸、抗生素生产中。 连续培养法 在往发酵罐中连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和产物的培养液，从发酵罐中连续放出，叫做连续培养法。其特点是能使微生物处于恒定不变的环境中进行长期持续的培养，该系统的稳态被叫做恒化器。同时包含了流入和流出，属开放系统，故变异菌株和杂菌污染随时间的延长而增大。从技术上也很难保证流入和流出速度的一致。连续培养用于废水处理、葡萄糖酸发酵、酒精发酵等工业中。补料分批培养法(流加法) 在分批培养时，不断地供给培养基，但所需产物不到一定时刻不放出的方法，称为补料分批培养法。用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。 (4)载体培养 载体培养脱胎于曲法培养，同时又吸收了液体培养的优点，是近年来新发展的一种培养方法。特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制，发酵结束，只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。载体的取材必须耐蒸汽加热或药物灭菌，多孔结构既有足够的表面积，又能允许空气流通。 3影响种子培养的条件 菌种扩大培养的关键就是搞好种子罐的扩大培养。影响种子罐培养的主要因素包括营养条件、培养条件、染菌的控制、种子的级数和接种量控制等 。泡沫 （1）泡沫的作用：培养过程中产生的泡沫与微生物的生长和合成酶有关，泡沫的持久存在影响着微生物对氧的吸收；妨碍二氧化碳的排除，因而破坏其生理代谢的正常进行，不利于发酵；由于泡沫大量生成，致使培养液的容量一般只能等于种子罐容量的一半左右，大大影响了设备的利用率，甚至发生跑料，招致染菌，造成巨大损失。（2）产生泡沫的原因通气和机械搅拌使液体分散和空气窜入，形成气泡；培养基中某些成分的变化或微生物的代谢活动产生气泡；培养基中某些成分(如蛋白质及其他胶体物质)的分子，在气泡表面排列形成坚固的薄膜。因此，气泡不易破裂，聚成泡沫层。（3）培养过程的消泡措施机械法化学法。发酵工业常用的消泡剂，有各种天然的动植物油及来自石油化工生产的矿物油、改性油、表面活性剂等。而新型的有机硅