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文档简介

1、 细胞培养上清：即在4下，首先300g离心10 min，吸取上清液，然后2 000g离心10 min；吸取上清液后，10 000g 高速离心30 min，吸取上清液；140000g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000g 再次离心90 min，100 L PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80备用。2、 将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37下凝结1小时而不进行抗凝。 此后，将其以2,000g离心持续10分钟获得血清。接着将血清以3,000g离心10分钟。 将上清液以无菌PBS以1：1的比例稀释并离心再次以10,000g保持30分钟，然后以200,000g进行2小时超速离心。 将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-m注射器过滤器过滤，并以200,000g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。3、为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。在4C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3.22） 0.1）注意：所有离心均应在4下进行。1.用等体积的PBS稀释液体。将稀释的液体转移到50毫升管中。在2,000g，4下离心30分钟。2.将上清液转移到超速离心管或瓶中，没有颗粒污染（参见基本方案1，步骤3注释）。在12,000g，4下离心45分钟。3.小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中（根据处理的液体体积，可参见表3.22.1中的管）。在110,000g，4下离心2小时。4.将沉淀重悬于1ml PBS中，并将其在其中一个管中汇集。用PBS填充管以大量稀释再悬浮液。5.通过0.22-m过滤器过滤悬浮液，并收集在新鲜的超速离心管或瓶中。6.在110,000g，4下离心70分钟。倒出上清液。7.将沉淀重悬于1ml PBS中，然后用PBS填充
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