芦荟组织培养概述.doc

摘要：随着芦荟在食品、医药等方面的深入研发利用,人们对芦荟的需求量逐年加大，用传统方法繁殖芦荟的速度都很慢，因而芦荟组织培养已成为芦荟快速大量繁殖的重要手段。关键词：芦荟；组织培养，应用技术中图分类号：S682.36芦荟(Aloe spp.)系百合科(Liliaceae)芦荟属(Aloe)多年生肉质草本植物，别名油葱、草芦荟、象胆、番蜡等。据文献记载, 世界野生芦荟种类(包括品种)有300 多个, 原产非洲大陆的有250个以上, 另外还有自然变异和人工杂交200 多个品种。我国海南、广西、广东、福建、云南、四川等地都有栽培。芦荟有食用、美容、保健、医药以及观赏等多种用途。近年来随着科技进步与发展，芦荟越来越成为一种有开发前景的经济植物。从芦荟的种植、研究到芦荟制品的生产，芦荟产业化已经形成，据国际芦荟科学委员会(IASC)资料显示，2001 年和2002 年全球的芦荟产品销售额已超过2 000 亿美元1。美国、日本和韩国等国家在这方面发展较快，我国则相对落后。种苗繁殖是芦荟产业的重要组成部分。芦荟的自然繁殖周期长，雌雄花开不同步，种子小而少，种子育苗困难。传统上芦荟均采用吸芽分生繁殖和根、茎扦插繁殖2,3，这些方法繁殖速度较慢，每株一年最多只能繁殖十几株4，且易积累病苗，造成芦荟的退化，难以满足规模种植对种苗的需求。而采用组织培养快繁技术不仅能保持品种的优良特性，还可不受外界条件的影响，周年繁殖，在较短时间内，繁育出大批种苗5。因此，组织培养技术对芦荟的繁殖具有很高的经济价值和广阔的市场前景。本文从外植体选择、培养基选择、芦荟的无性繁殖、小结与展望等方面，对近几年的研究概况进行综述，并就今后相关研究提出一些建议。1 外植体的选择外植体是指从植物组织或器官上切割下来并用于组织培养的原始体块，目前组织培养已经获得成功的植物，外植体几乎包括了植物体的各个部位。但是不同种类的植物以及同种植物不同的器官对诱导条件的反应是有差异的，有的部位诱导成功率高，而有的部位很难脱分化；有时，即使脱分化，再分化频率也很低，或者只分化出芽而不长根，或者只长根不长芽。因此，外植体的选择是组织培养中非常重要的一环。很多学者对芦荟不同外植体进行比较试验，苏海等6认为，二年生的库拉索芦荟(A. barbadensis)茎尖比茎段更容易诱导出不定芽，而且芦荟快速繁殖宜通过茎尖诱导出不定芽而获得无菌苗，这样省去了诱导愈伤组织步骤，缩短了诱导时间，而且可以减少种苗变异率。罗静等7比较了好望角芦荟(A. ferox)茎段、叶片和根段的再生能力，发现在同一培养基中培养10d后，茎段上开始出现不定芽，25d后每块幼嫩茎组织中可形成45个芽，而接种的叶片和根段无一例产生不定芽，说明茎段是芦荟组织培养中最佳的外植体材料。唐玉明等8、袁海英等进行了中国芦荟(A. vera var. chinensis)、木立芦荟(A. arborescens )和库拉索芦荟茎、叶作外植体的比较试验，发现以中国芦荟和木立芦荟的叶作为外植体，15d后外植体切口均变黑，30d后切口干缩，不能产生芽；而以茎段作为外植体，无论是中国芦荟还是木立芦荟，培养15d后各培养基均能产生一定数量的不定芽，库拉索芦荟茎的平均诱导分化率在90%以上，而叶片基本保持不分化状态。综上所述，芦荟茎尖和茎段有较强的再生能力，是较理想的外植体材料，而叶片和根段分化能力弱，作外植体一般难以诱导不定芽的形成。另外Richwine从库拉索芦荟未成熟花序中也诱导出芽对于芦荟叶片、叶鞘是否可以诱导愈伤组织，不同学者持不同观点。纪萍等9以木立芦荟、中国芦荟和木锉芦荟(A. humilis)的叶片、叶鞘为外植体进行组织培养，结果表明，木锉芦荟的叶片、叶鞘可以诱导形成愈伤组织，建立再生系统。吴红芝等10以木立芦荟的叶片、叶鞘及带腋芽的茎段为外植体进行试管培养，结果显示，叶鞘和茎段可诱导形成愈伤组织，腋芽直接萌生；叶片虽然能长时间保持鲜绿，却始终未分化。李琳等对库拉索芦荟茎段和叶鞘进行再生能力比较试验，发现茎段生长分化明显，大部分能诱导出芽，并且在添加活性炭的条件下容易诱导生根；而叶鞘组织的出芽率几乎为零，且在添加活性炭的培养基中几乎不生根，一段时间后，外植体切口因褐化而逐渐死亡，表明库拉索芦荟叶鞘组织基本不具分生能力。另外，吴红芝等、杜勇军等11分别以木立芦荟和中华斑纹芦荟(A. vera var. chinensis)为材料，证明叶基部也可以诱导出愈伤组织, 但中华斑纹芦荟叶片中部及顶端均不能诱导愈伤组织。这说明叶片和叶鞘能否作外植体，一方面可能与培养条件有关，另一方面也与品种有关，其真正原因有待探讨。2 培养基的选择培养基是活体植物组织体外保存、生长发育的营养来源。不同的植物都有自己最适合的组培培养基。多数学者认为，MS培养基适宜芦荟芽的分化和增殖培养。潘学峰等12筛选古巴芦荟(A. cubana)侧芽分化的最佳培养基时发现，MS培养基诱导出的侧芽数最多，是芦荟外植体侧芽分化最理想的培养基；其次是H培养基，较差的是KC培养基。柳建军等13、徐启红等以MS培养基对不同芦荟材料进行芽的分化和增殖试验都获得成功。但那宁馨等14在木立芦荟继代培养过程中发现芽苗、叶尖出现干枯似脱水状, 认为是由于培养基中离子浓度过高引起，改MS为1/2MS基本培养基后, 芽苗生长旺盛, 干枯率明显降低, 增殖率略增加，因而认为1/2MS培养基为木立芦荟较好的增殖培养基。芦荟生根培养一般采用1/2MS培养基。斯琴巴特尔等15、蒋林等16、铁军等17分别以1/2MS培养基对皂质芦荟(A. saponaria)、库拉索芦荟和不夜城芦荟(A. nobilis)进行生根培养，并获得成功。纪萍等9认为，木立芦荟、中国芦荟和木锉芦荟的丛生芽生根最佳培养基为1/2MS培养基。此外，一些学者对其他生根培养基也进行了探索，有人认为KC培养基对古巴芦荟根的分化有利。刘永提等18通过试验证明改良的MS培养基对普拉索芦荟(A. vera)生根效果最好，生根率达100%。3 芦荟的无性繁殖近年来，由于芦荟化学及药理学研究的深入，已形成了一股世界性的芦荟保健热。芦荟的栽培产业也已开始在我国兴起，但由于芦荟不能自花授粉结实，因此，用种子繁殖非常困难。目前的繁殖方法主要是分株和分蘖，但难以快速、大量地繁殖种苗，这也是当前芦荟种苗昂贵的重要原因之一。对芦荟茎尖进行组织培养快速繁殖试管苗的技术可在短期内繁殖上百万株的种苗，具有成本低，效益高的特点。 3.1 芦荟茎尖培养库拉索芦荟外植体19的诱导，主要有两种途径：一是通过茎尖或茎段诱导腋芽产生不定芽而获得无菌苗增殖；二是通过茎尖或茎段诱导愈伤组织，再从愈伤组织诱导分化出不定芽，然后用不定芽增殖。从快速繁殖种苗的角度来看，以茎尖或茎段诱导腋芽产生不定芽的途径效果较好，因为芦荟通过茎尖诱导很容易诱导出不定芽，省去了诱导愈伤组织步骤，缩短了诱导时间，而且可以减少种苗变异率。不同芦荟品种进行组织培养时，其培养基最佳成分和比例不同。6-BA 2.5 mgL和NAA 0.2mgL有利于库拉索芦荟不定芽的诱导，而IBA对芽的分化影响较大，尤其是高的浓度IBA不利于库拉索芦荟的增殖，对芽的分化有抑制作用。库拉索芦荟在开始启动分化及随后的1-2代培养中，可适当使用较高浓度的细胞分裂素，有利于加快繁殖，但如果长期使用高浓度的细胞分裂素容易使分化芽肿胀，愈伤组织增加，甚至出现白化苗现象。在第4代之后，需要逐渐减少生长调节剂使用量，以提高芽苗的增殖率。库拉索芦荟每一代培养最适宜天数在25-35 d，小于25 d或大于35 d都不利芽苗生长；培养时期限在55 d左右，若超过这个时限，芽苗呈现衰老迹象。在大规模生产中，常常需要考虑降低生产成本，通常可采用食用糖代替蔗糖(化学纯或分析纯)，自来水代替蒸馏水，自然光照代替人工光照等方法。黄贞光等人报道，组织培养中用食用糖代替蔗糖、用自来水代替蒸馏水，培养成本可降低30 。芦荟对光照条件要求不高，芦荟的增殖期采用自然光照或人工光照皆可，但如果光照过强，加上温度过高，分化苗容易出现僵化，不利于芦荟苗快速繁殖。在工厂化生产过程中应采取自然光照，以节省生产成本。此外，温度也对芦荟分化产生重要影响，温度过高或过低，都不利于分化。3.2 芦荟茎段培养茎段培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。孙立梅19等用木立芦荟(A loe A rbo rescen sM ill) 幼嫩茎段为试验材料。3.2.1培养基(1) 诱导分化培养基: MS+ 6-BA 0.5 2.0mg/L + NAA 0.10.5mg/L ; (2) 增殖培养基: MS+ 6- BA 1.03.0mg/L + NAA 0.10.2mg/L ; (3) 生根培养基: MS+ NAA 1.03.0mg/L 。培养基附加琼脂10g/L , 蔗糖浓度3% , PH5.8, 高压灭菌。3.2.2处理方法及培养条件将外植体用自来水冲洗干净, 用70% 乙醇处理30s, 再用011% 的HgCl2 消毒处理5m in, 然后用无菌水冲洗68 次, 用消毒滤纸吸干表面水分3 。在无菌条件下, 将外植体切成015cm大小的块, 接种于培养基(1) 上。培养温度224,采用自然光,光照强度不定。3.2.3愈伤组织的形成及芽的分化外植体接种2周后, 开始变白膨大, 在靠近培养基附近长出乳白色愈伤组织, 以后有些愈伤组织有绿色出现并有少量丛生芽形成。其中培养基MS+ 6 - BA 1.0mg/L +NAA 0.2mg/l 出现芽最早为20d。3.2.4芽的增殖将小芽分离转移到培养基(2) 上, 20d 后形成芽丛。不定芽在培养基(2) 上迅速增殖,20d 可继代1次。1个月内芽数可增殖35倍。由表可见芦荟不定芽形成的最佳激素浓度是: 6- BA 2.0mg/L 、NAA 0.1mg/L 。3.2.5根的诱导待无根苗长到34cm 高时, 切取无根苗接种于培养基(3)上。10d 后, 分化出不定根; 20d 后长出510条白色根, 生根率100%。由表可见NAA 促进生根的最佳浓度为1.0mg/L 。试验表明：（1）不同激素的种类和浓度对芽的诱导、增殖和根的形成有很大影响。一定浓度的BA可促进细胞分裂和诱导芽的分化，较高浓度的BA有利于丛生芽的形戚。NAA在较低的浓度下有利于外植体组织的退分化，NAA在较高浓度对，有利于根的形成，但过高的浓度易使其形成肿胀粗根。（2）MS培养基中附加激素：6-BA和NAA可在一定范围内诱导愈伤组织的形成，芽的分化增殖及生根 经实验得出适合木立芦荟离体培养的最佳培养基配方是：诱导分化培养基：Ms-F 6-BAI04-NAA0.2mgL增殖增养基：MS 6-BA 0.20.4mg/L, NAA 00.1 mgL生根培养基：MS4-NAA1.0mgL。但对于不同品种，培养基的最佳激素浓度不一定是相同的。3.3 芦荟叶片培养芦荟植株要生长数年后才开花结实，由于雌雄花开放时间不一致，种子很少而且很细小，因此用种子育苗很困难，传统上多用分株法繁殖，繁殖系数很低。为了满足生产上对种苗的需求，加快引进的优良品种的推广，组培方法已成为快速生产种苗的主要手段。 3.3.1 6-BA和NAA对芦荟分化的影响于惠敏、金东庆、张晓东等20在芦荟组培快繁研究中以MS为基本培养基，6-BA和NAA分别以几种不同的浓度组合进行处理时，对芦荟分化的影响。表明：分化系数及其生长量不仅取决于6-BA、NAA的浓度和外植体的质量，而且取决于激素的配比。在外植体质量相同的情况下，6-BA和NAA达到设定的最低或最高浓度时，分化系数较小；6-BA为3mgL，NAA为0.2mgL时，分化系数较高。3.3.2 NAA对不定芽形成的影响 在MS+NAA 0.1mgL培养基中分别加入BA l mgL，BA2mgL，BA3mgL，BA4ragL，BA5mgL，BA6mgL，组成6组培养基，用芦荟叶片接种后，每一处理的叶片均不分化出不定芽，只是在叶片切口处长满愈伤组织，接种30天后，愈伤组织分化出很多不定根；MS+NAAA0芦荟1mgL + BA 1 mgL处理组的叶片的不定根数多且粗壮，随BA浓度增加，不定根的数量逐渐减少。以后把这些长不定根的叶片转移至没有NAA的Ms+BA3ragL培养基中，没有发现有不定芽产生，可见在有NAA存在(即使浓度很低)的情况下，虽配合以不同浓度的BA，仍然不能诱导芦荟叶片不定芽的形成 ，而只会诱导产生不定根。 3.3.3 NAA浓度对生根的影响其后他们又以12MS为基本培养基，5种不同浓度的NAA对芦荟茎段再生苗生根的影响见表2。试验表明：NAA浓度在0-0.3mgL范围内，每株再生苗生根率及根数随浓度的增大而增加；超过0.3ragL时，生根率反而下降。因此，适宜的NAA浓度为0.3mgL，并且生根率最高，达88.2；生根条数也最多，平均每株4.8条。NAA对叶段来源的再生苗生根的影响具有相似的规律性，叶段再生苗的生根率和每株根数与茎段再生苗没有大的差别。4 小结与展望 芦荟的组织培养是解决芦荟种苗来源的一个重要途径，是实现芦荟产业化生产的基础。虽然目前有少数芦荟品种的组织培养获得成功，但对这些品种的外植体选择、培养基的设计、植物生长调节物质和培养条件的控制等方面，还有待进一步研究，以提高芦荟的繁殖率和存活率；同时要对其它品种进行研究，摸索合适的组培方法。另一方面，芦荟的组培还仅限于试验研究和小规模生产，需要探索组培条件的控制，实现芦荟种苗生产工厂化、自动化，才能满足产业化需求。最后，还应把芦荟的组织培养与基因工程、细胞工程结合起来，以创造新的芦荟品种，改善芦荟产品品质。参考文献：1 周治德. 国内外芦荟提取物的市场现状及发展趋势EB/OL. 2006-4-21.2 朴泰浩. 芦荟组织培养快速繁殖技术的研究J. 中国野生植物资源, 1994(4): 44-46.3 丰锋,等. 芦荟的组织培养J. 北方园艺, 2000(1): 38-39.4 华春,等. 芦荟组织培养和快速繁殖技术J. 生物学通报, 2001,36(7): 47.5 曹孜义,等. 实用植物组织培养技术教程M. 兰州: 甘肃科学技术出版社, 2002.6苏海,等. 库拉索芦荟组织培养技术研究J 广东农业科学, 2003(3): 27-287罗静,等. 好望角芦荟的组织培养与快速繁殖J 安徽农业科学,2005,33（7:1213-1231）8唐玉明,等. 两种芦荟的组织培养研究J. 西