沃特世网站资料.doc

HPLC - 液相色谱什么是液相色谱?历史概述和定义液相色谱的定义是二十世纪早期由俄罗斯植物学家 Mikhail S. 茨维特提出的。他最先尝试在装满颗粒的柱子上使用溶剂来分离从植物中提取的化合物树叶色素。茨维特用颗粒填满开口的玻璃柱。他发现两种特殊的材料，粉笔末(碳酸钙)和氧化铝很有用。他将样品混匀植物叶的溶剂提取物倒入柱中，并让样品流过颗、粒床。随后加入纯溶剂。随着样品由于重力自上而下流过柱子，可看到不同颜色的谱带被分开，因为有些组分比另外一些移动得快。他将这些分开的不同颜色的谱带与样品中原有的不同化合物相关联。他还根据每一种化合物对填料的化学亲和性强弱，提出了分析这些化合物的分离规律。与颗粒填料有较强亲和性的化合物移动慢，与溶剂有较强亲和性的化合物移动快。这个过程可这样描述:样品中的化合物在流动的溶剂(流动相)与固体颗粒(固定相)间的分布不一样。这样使每一种化合物以不同的速度移动，从而产生了化合物之间的分离。茨维特使用色谱法 chromatography 来自希腊字， chroma 意思是颜色， graphy 意思是记录 - 直译为颜色记录 来描述他的彩色试验。令人好奇的是, 俄罗斯名字茨维特意思是颜色。今天，液相色谱法,以各种形式，已成为分析化学中最有力的工具之一。 技术1. 样品被点在固定在玻璃板上的薄层色谱颗粒固定相上，并流过薄层图 B。玻璃板的底端放置在溶剂中。由毛细作用产生的流动使溶剂流动相扩散到干燥的颗粒层并沿玻璃板向上移动。这种技术被称为薄层色谱法或 TLC。 技术 2. 在图 C 中, 样品被点在纸上固定相。溶剂流动相 加在样品点的中心以产生向周围的辐射流动。这是纸层析的一种方式。传统的纸层析色谱和直线流动的薄层色谱是类似的操作方式。上图中，相同的黑色 FD 和 C 染料被点在纸上。图 C: 纸层析法当和薄层色谱板比较的时候，请注意这种特殊纸张分离能力的区别。绿色圆环表示这张纸无法分离黄色和蓝色染料，但它可以将红色染料分离开来。下图中，由同样的黄色和蓝色染料组成的一个绿色样品点在纸上。如你能预料的，这张纸无法分离这两个染料。在图中，由红色和蓝色组成的紫色样品被点在纸上，它们被分离得很好。技术3.在这个最有效的方法中，样品流进一个柱子或填有适当颗粒固定相的柱管装置。这些颗粒称为色谱填料。溶剂流动相流过这个装置。在固相萃取中SPE，样品被装入柱管里，溶剂携带样品流出这个装置。正如在茨维特的试验中，样品中化合物由于在管路中的流动速度不同而得以分开。黑色样品被放入柱管里。每一步使用不同溶剂得到分离。图 D-1: 柱色谱法 - 固相萃取 SPE当使用管路的形式时，有几种方法可以产生流动。重力或真空可用在不能承受压力的柱子上。特别是，本试验中使用的颗粒粒径较大大于五十微米，所以产生的流动阻力很小。开口玻璃柱茨维特的实验是个典型的例子。除此之外，小型塑料柱，典型的例子是针筒的形状，可装入填充物颗粒用于分离样品。这种方法称为固相萃取SPE。在此，管状的色谱装置称为固相萃取小柱，通常在真空助力下流动，被用来净化复杂样品以便进一步分析。要想提高分离能力，必须使用粒径小的填料颗粒小于十微米。然而，小颗粒对流动产生更大的阻力，所以要获得预期的溶剂流速，需要更高压力。必须设计能承受更高压力的泵和柱子。利用中高压力使溶剂流过色谱柱的方法，就称为 HPLC。图 D-2: HPLC柱什么是高效液相色谱法HPLC?缩写 HPLC, 引自 Csaba Horvth 教授之后在 1970 年匹茨堡大会上的文章，原指在填料柱中产生所需的流速需要高压 (high-pressure) 这个事实。早期的泵只能承受 500 psi 35bar。这就被称为高压液相色谱法HPLC七十年代早期取得极大进步。新型的高压液相色谱仪器可以承受 6,000 psi 400 bar的压力，还能配上改进的进样器，检测器和色谱柱。高压液相色谱法确实开始成为二十世纪七十年代中晚期的普遍分析方法。随着这一期间不断的性能改进更小颗粒，更高压力, 字母缩写保持一样，但全称变为高效 (high-performance) 液相色谱HPLC。高效液相色谱HPLC是目前分析化学最强大的工具之一。它能够分离、定性和定量任何可以溶解在液体中的化合物。今天，痕量化合物甚至低至千万分之一ppt也可高效液相色谱如何工作? 图 E 描述了高效液相色谱系统的各组成部分。一个储液瓶装有溶剂称为流动相，因为溶剂是流动的。一个高压泵溶剂传输系统或称溶剂管理器用来产生和计量流动相的流速，一般是毫升/分钟。一个进样器样品管理器或自动进样器可以将样品导入注射连续的流动相 ，并由流动相携带样品进入高效液相色谱柱。色谱柱装有能获得分离效果的填料。这种填料称为固定相因为它被柱硬件包围住。检测器用来查看化合物流出色谱柱时被分开的谱带大多数化合物没有颜色，所以人眼观察不到。流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。这种方法称为制备液相在高效液相色谱量级中讨论。注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。检测器连接计算机数据站，高效液相色谱系统单元先记录电信号，再将电信号转换为色谱图，在显示屏上展现出来。定性和定量样品内溶物浓度(如图F)。由于样品中化合物性质差异很大，几种类型的检测器被开发出来。例如，如果一个化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收检测器。如果这个化合物发荧光，可使用荧光检测器。如果该化合物没有上述性质之一，可使用更广泛的检测器，如蒸发光散射检测器ELSD。最强大的方式是顺序使用多个检测器。例如，紫外和/或蒸发光检测器可和质谱仪MS联用来分析色谱分离的组分。这样，从一次进样，可得到分析物的更多综合的信息。将质谱与高效液相色谱系统耦合称之为液质用.高效液相色谱操作一个简单的方法来理解如何获得样品中化合物的分离，如图 G 中简图所示。流动相从左侧进入色谱柱，流过颗粒层，再从右侧流出。绿色箭头代表流动方向。首先，上图表示在零时的色谱柱进样时，当样品进入色谱柱并开始形成一个谱带。这里显示的样品，是黄色、红色和蓝色染料的混合物，在进样口形成一条单一的黑色样品带。现实中，这个样品可以是任何能够溶解在溶剂中的物质；一般来说化合物是没有颜色的，色谱柱壁也不透明，所以我们需要一个检测器来查看洗脱出来的分离组分。几分钟后 下图, 流动相连续并稳定通过填料层，我们可以看到不同的染料已经以不同的速度在分离开的谱带中移动。这是因为在流动相和固定相之间存在对每种染料或分析物的吸附竞争。留意黄色染料谱带移动最快，即将流出色谱柱。黄色染料比其他染料更喜欢被吸附于流动相。因此，它的流动速度较快，更为接近流动相的速度。蓝色染料谱带喜欢填料而不是流动相。它与填料颗粒有较强的吸附力使得它移动明显更慢。换句话说，它是这个混合样品中最强被保留的化合物。红色染料谱带对流动相吸引力一般，因此在色谱柱中的移动速度中等。由于每一种染料谱带移动速度不同，我们能够进行色谱分离。Figure G: Understanding How a Chromatographic Column Works - Bands什么是检测器?当分开的染料谱带离开色谱柱后，它们马上进入检测器。检测器带有可以在流动相背景下看检测到每个分开的化合物谱带的流通池如图 H。 实际上，在通常的高效液相色谱分析浓度下许多化合物的溶液都是无色的。一个合适的检测器有能力辨别化合物的存在，并发送相应的信号到计算机数据站。正如前面谈到的，根据所需分离和分析的化合物的特性和浓度，可以在众多的检测器中选择其一。什么是色谱图?色谱图表示发生在高效液相色谱系统中的化学色谱分离。一系列从基线出现的峰以时间为坐标。每个峰代表对不同化合物的检测器反应。色谱图由计算机数据站描绘。如图 H. Figure H: How Peaks Are Created图H中，黄色谱带完全通过了检测器流通池；产生的电信号被送到计算机数据站。得到的色谱图逐渐出现在屏幕上。请注意从进样开始，色谱图就在屏幕底部形成直线。这条直线称为基线，它代表随时间变化，纯流动相通过流通池。随着黄色分析物谱带穿过流通池，一个较强信号被传送到计算机。这条曲线，开始是上升，之后下降，和样品谱带中的黄色染料的浓度成正比。这就形成了色谱峰。当黄色谱带完全流出检测器的流通池，信号强度回到基线水平，而流通池现在又一次，只有流动相。由于黄色谱带流动最快，首先从色谱柱洗脱出来，所以这是第一个峰。之后，一个红色谱带到达流通池。从红色谱带进入流通池开始，信号从基线抬起来，代表红色谱带的色谱峰被划出来。在本图中，红色谱带还没有完全通过流通池。图中所示是如果我们此刻停止该过程，红色谱带和红色色谱峰的样子。由于红色谱带的大部分已经通过了流通池，色谱峰的大部分已经被划出来，如实线所示。如果我们能再开始，红色谱带能完全通过流通池虚线。最强保留的蓝色谱带流速最低，在红色谱带之后流出。虚线表示如果我们连续完成，一个完整的色谱图如何出现。有意思的是蓝色峰的宽度将是最宽的，而蓝色分析物谱带的宽度在柱子上、是最窄的，而从柱中流出时变得最宽。这是因为它在色谱柱填料床中移动较慢，需要较多时间和流动相体积才被完全洗脱出来。由于流动相在一个固定的速度下移动，这意味着蓝色谱带展宽和变稀。由于检测器的反应与谱带的浓度成正比，因此蓝色峰高较低，而宽度较大。高效液相色谱分离模式 总的来说，化合物的三种主要的性质可以用来产生高效液相色谱分离。它们是： 极性 电荷 分子大小首先，让我们考虑极性和根据这一特性的两种主要分离模式：正相和反相色谱。基于极性的分离一个分子的结构、活性和物化性质由组成它的原子和化学键决定。在一个分子内部，决定了其特殊性质和可预测的化学反应的某些原子的特定排列，称为官能团。这个结构经常决定这个分子是极性还是非极性。有机分子根据它含有的主要官能团来分类。使用基于极性的分离模式，不同分子的相对色谱保留时间大都由这些官能团的本性和位置决定。如图 P 所示，不同类的分子可按照它们相对保留时间排列，形成从强色谱极性到强非极性的谱图。图 P:分析物官能团的色谱极性图水带有强偶极矩的小分子是极性化合物。苯一个芳香族碳水化合物是非极性化合物。具有相似色谱极性的分子相互吸引，如果极性不同相互的吸引力会减弱，极端的情况是相互排斥。这是基于极性的色谱分离模式的基本原理。另外一种方式来思考是以此类推：油非极性和水极性不相容。不像磁体是异性相吸，基于极性的色谱分离是根据相似物的相互吸引和不同物质的相互排斥。记住在基于极性的色谱中相似物相互吸引。图 Q: 适当流动相和固定相的组合影响基于极性的分离设计一套色谱分离系统如图Q，我们通过选择流动相和固定相制造样品中各种化合物的竞争。这样，样品中和固定相柱填料极性相似的化合物将被延迟因为它们更强地被颗粒吸引。而和流动相极性相似的化合物将优先被吸引而移动较快。 基于极性的分离 极性分子非极性分子这样，基于流动相和固定相对不同化合物的相对吸引力不同，改变分析物速度就产生了分离。图 R-1, R-2 和 R-3 分别列出了流动相，固定相和样品分析物的典型色谱极性范围。我们看看每一种情况，色谱学家如何选择适当的流动相和固定相以形成吸附竞争，获得基于极性的高效液相色谱分离。图 R-1: 流动相色谱极性谱图一个坐标上，如图R-1，一些常用的溶剂按相对色谱极性形成的排列，称为洗脱顺序。与分析物有效竞争固定相的流动相分子，替换分析物，使得分析物在色谱柱中加速移动弱保留。水在流动相坐标的极性端，而己烷，一种脂肪族烃类化合物在非极性端。在两者之间，单一溶剂以及易混合的溶剂混合物按比例混合以满足特殊要求，可以按洗脱强度顺序排列。最强流动相端的位置与分析物发生竞争的固定相表面性质有关。图 R-2: 固定相颗粒色谱极性图硅胶具有活性，亲水性表面，含酸性硅烷醇含硅胶的乙醇同原物官能团。因此，它在固定相的极性端，如图 R-2 所示。硅胶表面的活性或极性可与弱极性官能团相结合的化学键选择性地修饰。这里所举的例子是为了降低极性，氰基CN，正辛基C8，十八烷基C18,ODS与部分硅胶结合。后者是疏水性憎水的的，极强非极性填充方式。图 R-3: 化合物/分析物色谱极性图图 R-3 重复了我们样品的色谱极性图如图 P。考虑到流动相和固定相的极性，对于某一固定相，色谱学家必须选择一个流动相，使得感兴趣的分析物可以结合在色谱柱上，但不能太强而洗脱不下来。在具有类似极性强度的溶剂中，色谱学家考虑固定相和流动相的配合，可以区分分析物极性和溶解性的更微弱的差别，使色谱系统的选择性最大化。同性相吸，但从目前的讨论可以想象，基于极性的分离是涉及到对样品的理解和各种分析物及保留模式的经验。总而言之，色谱学家会选择最佳的具有合适相反相极性的流动相合固定相的组合。之后，当样品流过色谱柱的时候，同性相吸的原则将决定哪一种分析物流速放缓，哪一种流速更快。正相高效液相色谱在植物提取物的分离过程中，茨维特成功运用极性固定相玻璃柱中的粉笔末; 如图A和弱极性非极性流动相。这种经典的色谱模式被称为正相。图 S -1: 正相色谱法图 S -1 代表三个染料混合物的正相色谱分离。极性的固定相最强地保留了极性的黄色染料。相对非极性的蓝色染料在非极性溶剂的流动相保留竞争中胜出，很快被洗脱出来。由于蓝色染料最像流动相两者都是非极性，它流动得更快。对硅胶柱正相色谱来说，典型的情况流动相是100% 有机相，不含水。反相高效液相色谱反相是指与正相恰好相反的色谱模式，即使用极性流动相和非极性疏水性固定相。图 S-2 描述了三种染料的黑色混合物被该种方法分离的过程。图 S-2: 反相色谱法现在最强保留的化合物是非极性较强的蓝色染料，因为它与非极性的固定相吸附最强。极性的黄色染料，较弱保留，在极性水性流动相的竞争中胜出，流过填料床最快，最早被洗脱出来正是同性相吸。今天，由于其更好的重现性和更广泛的应用，反相色谱占所有高效液相色谱方法的75%。大多数方法使用水和极性溶剂的混合物，如乙腈或甲醇。这样一般来说能保证分析物与非极性，疏水性颗粒表面的适当相互作用。C18合硅胶有时称为ODS是最普遍的反相高效液相色谱柱填料。图 S-2: 反相色谱法 反相高效液相色谱 表C给出基于极性分离的两种主要高效液相色谱的固定相和流动相特性的总结。记住，基于极性的模式，同性相吸。表 C: 基于液相分离的两相特性亲水作用色谱HILIC亲水作用色谱HILIC可以看作是正相色谱的一种变化。正相色谱中，流动相是百分之百有机相。只有痕量水分存在于流动相和极性填料的空隙里。极性分析物与极性固定相较强吸附，不会被洗脱下来。在有机流动相典型的是具有质子惰性的溶剂，如乙腈中加入一些水分20%，就可能分离和洗脱在正相模式下强保留或反相模式下弱保留的极性化合物。水是强极性溶剂，和极性分析物有效竞争固定相。亲水作用色谱HILIC 可以在等度或梯度洗脱模式下运行。随着流动相极性强度的增加加入更多水，最初吸附在极性填料颗粒的极性化合物可以被洗脱下来。分析物按照亲水性相对水的色谱极性由低至高的顺序被洗脱出来。缓冲液或盐可加至流动相中以保持离子化的分析物呈单一形式。疏水作用色谱HIC疏水作用色谱HIC是一种反相色谱用来分离大的生物分子，如蛋白。这些分子通常为保持原形而置于水溶液中，避免和会使其变性的有机溶剂或表面接触。HIC 通过疏水性固定相来达到大分子疏水目的，例如，是C4硅胶柱而不是C18硅胶柱。起始阶段，水中高盐浓度将帮助填料保留盐析蛋白。梯度分离经常是通过递减盐浓度来进行。这样，生物分子按照疏水性由低到高被洗脱出来。基于电荷的分离: 离子交换色谱IEC基于极性的分离，同性相吸，异性相斥。基于电荷的离子交换色谱和其他分离方式，规则是相反的，同性相斥，异性相吸。离子交换分离的固定相以表面酸碱性强弱和吸附保留的离子类型来划分。阳离子交换是用负电荷表面来保留和分离带正电荷的离子。反之亦然，阴离子交换是用正电荷表面来保留和分离带负电荷的离子如图 T 。每一种离子交换类型，都至少有两种分离和洗脱方法。图 T: 离子交换色谱法强离子交换体系具有易离子化的官能团即，季胺类或磺酸类。它们主要用于保留和分离弱离子。这些弱离子可被含有可更强吸附在固定相表面的离子的流动相洗脱或代替。或者，弱离子可以被保留在柱上，之后通过原位改变流动相的pH值被中和，使其失去吸附力而被洗脱。弱离子交换体系如，二胺类或羧酸类可能在某个pH值以上或以下被中和而失去保留带电离子的能力。当携带电荷时，它们用来保留和分离强离子。如果这些离子不能被替代物洗脱，固定相交换点可能被中和而切断离子化吸附，使得带电分析物被洗脱下来。表 D: 离子交换纲要当弱离子交换体系被中和，它们可以通过疏水性反相或亲水性正相相互作用保留和分离化合物; 在这样的情况下，洗脱强度由流动相的极性来决定图 R -1。因此，弱离子交换体系可用于混合分离模式同时基于极性和电荷的分离.表 D 列出离子交换的主要分类纲要。例如，保留强碱性分析物总是带正电荷，在pH值大于 7 时使用弱阳离子-交换固定相颗粒，可以产生阴离子颗粒表面。为了释放或洗脱强碱物质，降低流动相 pH 值至 3 以下; 可以去除表面电荷，切断离子交换保留机理。pKa 值是 50% 的官能团被离子化，50% 的官能团为中性时的 pH 值。为保证完全中性，或完全带电，分析物或颗粒表面pH值必须调整到比 pKa 值高两个数量级才合适如表 D 所示。不要使用强-阳离子交换体系保留强碱物质; 两者都带电荷并强烈地相互吸引，使得碱性物质几乎无法洗脱出来。只能用更强保留的竞争型碱物质来冲洗这个强阳离子交换体系，赢回活性交换位点，替换目标化合物。这种做法在高效液相色谱和固相萃取 SPE 几乎没有实用性，也不安全。强酸和强碱在操作中很危险，可能对高效液相色谱流路材料具有腐蚀性 。基于尺寸大小的分离排阻色谱SEC - 凝胶渗透色谱GPC十九世纪五十年代，Porath 和 Flodin发现生物分子可以通过过滤或流经孔径可控的亲水右旋糖苷聚合物时按照大小被分开，而不是基于电荷数或极性。这个过程被称为凝胶过滤。后来，一种类似的装置，使用特定孔径范围的有机聚合物填料可分离合成寡聚物和多聚物。这个过程成为凝胶渗透色谱GPC。使用孔径可控的硅胶填料操作类似的分离过程被称作排阻色谱SEC。世界上第一台用于 GPC 的商业化高效液相色谱仪出现在 1963 年参见参考文献3. 基于尺寸大小的分离: 排阻色谱 总结 所有这些技术通常是通过固定相来实现。这些固定相为使得感兴趣的分析物进入或不能进入孔内而被合成为一定孔径分布的填料。小分子在通过填料床时更多地进入到颗粒孔隙中。大分子只能进入某一尺寸以上的孔隙，所以在填料床停留的时间较短。最大的分子可能完全不能进入孔内而只在颗粒间通过，因此被小体积流动相很快洗脱出来。选择流动相有两个理由：第一，对被分析物来说是良好的溶剂；第二，可以防止被分析物和固定相表面的相互作用基于极性或电荷。这样，大分子先洗脱出来，小分子流动慢因为它们流进更多的孔内再流出而后洗脱出来，按照在溶液中的尺寸由高至低的顺序。因此，简单的规则：大的先出来。由于可以将聚合物的分子量和溶液中的大小相关联，即 GPC 革命性地实现聚合物分子量分布的测量，那样就可以决定聚合物物理特征，从而可提升或减少聚合物生产工艺，质量和性能如何分辨好的和差的聚合物.总结我们希望您已经浏览了以上高效液相色谱技术简要介绍。我们鼓励您阅读以下参考文献并学习附录中的高效液相色谱名词解释。您也可以登录沃特世图书馆网站，浏览超过50,000篇关于高效液相色谱, 固相萃取和质谱应用的参考文献。附录: 高效液相色谱名词解释 氧化铝Alumina一种多孔微粒状的铝氧化物Al203，用作正相吸附色谱的固定相。氧化铝有高活性碱性表面；10% 的浆态 pH 值是 10。用强酸清洗可成功变至中性或酸性范围浆态pH值分别是 7.5 和 4 。氧化铝比硅胶吸湿性强。它的活性根据 Brockmann 级含水量衡量：如活性一级含水1% 。基线*Baseline*仅有流动相从色谱柱通过时色谱图记录的检测器响应信号。管状柱Cartridge一种色谱柱，没有末端装置，只是一个空管，填充材料被两端玻璃简单封口。固相萃取色谱柱可平行地在真空状态下操作。高效液相色谱柱放置在支架上，每一端都有流路连接。色谱柱容易拆换，价廉，比常规的集成末端管体的色谱柱方便。色谱图*Chromatogram*表示分析物流出浓度的图形或检测器响应信号或其他量化信号对时间或洗脱体积的曲线图。在平面色谱即：薄层色谱或纸色谱中，色谱图指含有的分离区域的纸或层。色谱法*Chromatography*一个动态的物理化学分离方法，它利用组分在两相中的分配不同而分离，一种是固定的固定相，另一种流动相相对固定相而移动。柱体积* VcColumn Volume* Vc装填料部分的管路几何体积管内衡截面积乘以填料床长L。色谱柱的颗粒间体积也称为粒间体积，是指流动相在填料床颗粒间占据的体积。空隙体积V0是流动相所占有的总体积，即粒间体积和颗粒内体积 也称为孔隙体积的总合。检测器*Detector* 见灵敏度通过测量物理或化学性质如，紫外/可见光吸收，示差折光率，荧光或传导率，来表示流出物组分变化的器件。如果检测器的相应信号与样品浓度成线性，通过适当的标准样品校准后，可以定量某个组分。通常，使用两种不同的检测器对分析有帮助。这样，可得到样品被分析物的更多确定的或特定的信息。有些检测器如，电化学，质谱是破坏性的；即它们使样品组分发生化学变化。如果这种检测器和非破坏性的检测器耦合使用，破坏性的检测器往往放在后面。显示Display以色谱图的形式将检测器的电子响应信号在计算机屏幕上记录下来。先进的数据记录系统也能从事复杂的数学计算，如，峰面积积分， 基线扣除，匹配光谱，定量组分以及根据标准谱库比对鉴定未知物。洗脱物Eluate从色谱柱出口流出含有被分析物的液体部分。在分析型高效液相色谱, 洗脱物的浓度或其中分析物的分子量由检测器测量。在制备型高效液相色谱中, 洗脱物按照均一的时间或体积间隔被连续收集，或者在检测器显示感兴趣目标存在时不连续收集。 这些组分随后将处理得到纯化合物。洗脱液Eluent流动相 见洗脱色谱。洗脱顺序Eluotropic Series参照在一个标准吸附剂上的特定分析物，溶剂按洗脱强度排序。当开发等度和梯度洗脱方法时，这种顺序很有用。Trappe 在利用自低而高的溶剂极性强度序列在矾土上分离油脂组分后创造了这个名词。 后来，Snyder 测量了众多溶剂的强度在正相 LC 吸附剂上的参数并将其列在表格中。 Neher 创造了一个很有用的表图，从中可以选择正相溶剂的同等洗脱相同洗脱强度混合物来优化薄层色谱 TLC 分离的选择性。一个典型的正相洗脱顺序可以从弱端的非极性脂肪族碳水化合物开始，即戊烷或己烷，之后进一步到苯芳香族碳水化合物，二氯甲烷氯化物，二乙醚，乙酸乙酯酯类，丙酮酮类，最后，甲醇醇类在最强端如图 R-1。洗脱* 动词Elute* verb用洗提色谱法分离。当所有样品组分还在色谱填料床中，洗脱过程可以中止平面薄层或纸层析或连续操作直到组分已经离开色谱填料床柱色谱。注：洗脱这个术语，为了避免和实际方法开发的混淆，更倾向于表示开发在平面色谱中使用的术语一个为特定分离而优化的分离体系(流动相合固定相)。洗脱色谱* Elution Chromatography*流动相连续通过填料床的色谱分离过程。在高效液相色谱中，一旦检测器基线稳定，分离系统达到平衡，一定量的样品被注射入流动相。直到所有目标分析物都通过检测器，洗脱过程才停止。洗脱强度Elution Strength相对于固定相上的分析物的溶剂亲和性的衡量方法。一个弱溶剂不能替换分析物，使分析物较强地保留在固定相上。一个强溶剂可以完全替换并携带所有分析物分子无保留地通过色谱柱。为了获得有效分离和合理洗脱体积的适当平衡。溶剂经常被掺杂造成两相间的竞争，对特定分析物达到优化选择性和分离时间的目的参见选择性.偶极，介电常数，氢键，分子大小和形状以及表面张力都影响到洗脱强度。洗脱强度也由分离模式决定。在吸附或正相条件下，溶剂的洗脱顺序可能由低到高排列，而在反相分离条件下，这个顺序可能几乎相反如图 R-1。荧光检测器Fluorescence Detector荧光检测器在特定光学波长激发样品。这样会使某些化合物产生荧光并在更高波长下发光。设在特定发射波长下并不会被激发光源遮挡的传感器只收集发射光。通常常原来不能被动产生荧光的分析物也可被衍生化，从而可以采取这种高灵敏度和选择性的检测方式，即，氨基酸 AccQ流速*Flow Rate*在单位时间内通过色谱柱的流动相体积。在高效液相色谱系统中，溶剂传输系统泵的流速由控制器设定。通过定时收集和测量的色谱柱出口流出液，可检查流速精度。由于溶剂的密度随温度的不同而变化，任何校准或流速测量必须考虑这个变化。如果可能，最准确的测量是通过重量而不是体积。流速的一致性 精度 和重现性对许多液相技术来说是至关重要的，特别是在分离过程中，保留时间是分析物鉴定的关键，或者，在凝胶渗透色谱中，保留时间的校准和相关性是测量聚合物精确分子量分布的关键。通常，分离条件用线速度来比较，而不是流速。线速度是用流速除以柱子横截面积计算得到。流速用体积/时间如, 毫升/分钟表示，线速度用长度/时间如, 毫米/秒表示。凝胶渗透色谱*Gel-permeation Chromatography*基于分子大小和/或形状排除效应的分离。凝胶渗透色谱和凝胶过滤色谱描述固定相是胶体的分离过程。两者都是体积排除色谱法。Porath 和 Flodin首先描述的凝胶过滤，是使用葡聚糖凝胶和水相流动相来进行基于分子大小的生物分子分离。 梯度Gradient流动相中两种或多种混合溶剂浓度配比随时间的变化会引起洗脱强度的增加。分段梯度常用于固相萃取；每一步，洗脱液中的流动相会由从弱至强地突变。还有可能，在两步之间，通过排空固相萃取吸附剂床层，从一种溶剂换成另一种不相溶的溶剂。进样口Inlet流动相和样品进入色谱柱的一端。多孔的，惰性玻璃材料保留了填料，保护吸附剂层入口不受微粒污染。好的高效液相色谱试验规定样品和流动相不含微粒，这种要求对于入口容易堵塞的小粒径色谱柱来说是强制性的。如果柱床进样口被堵住而产生比平时高的反压，有时，反转流动方向，使流出液进入废液瓶，可以冲开堵塞，洗掉停留在表层的碎片。如果碎片已经流过表层，进入床层进样口端，那么色谱柱很可能就到使用寿命液相色谱* LCLiquid Chromatography* LC流动相是液体的一种分离技术。液相色谱方法可在色谱柱上或平面薄层色谱 TLC 或纸色谱上使用。现代液相色谱技术使用更小的颗粒和更高进样口压力，从 1970 年开始被称为高效（或高压）液相色HPLC。2004 年，超高效液相色谱使液相的性能极大地提升到了新高度参见超高效液相色谱 UPLC 技术。流动相* 参考洗出液，洗提液 Eluate, EluentMobile Phase* see Eluate, Eluent按照某一方向从固定相吸附床层长度方向渗流过的流体。流动相可以是液体液相色谱或气体气体 或超临界流体超临界流体色谱法。气相色谱法中，名词载气就是流动相。在洗提色谱法中，流动相也可叫做洗提液，而洗出液被定义为流动相通过吸附剂后含有目标化