谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定.doc

谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定 一、实验目的 1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用 2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力 3.学习治疗检测SGPT的方法及原理 4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。 二、仪器与试剂 1实验材料 动物肝脏 2实验试剂 10.9NaCl溶液 2海砂 31谷氨酸溶液1KOH溶液中和 41丙酮酸钠溶液用1KOH溶液中和 50.1KHCO3溶液 60.025一溴乙酸溶液用1KOH中和 72乙酸溶液 8酚的饱和水溶液将2份酚和2份水按重量计算混合放入分液漏斗中振荡。静止24h以后分层将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周。 90.1水合茚三酮的正丁醇溶液 100.1标准谷氨酸溶液 110.1标准丙氨酸溶液 121KOH溶液 谷丙转氨酶活性的鉴定纸层析法 一、实验原理 观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。 二、实验操作 1.谷丙转氨酶提取液制备2g肝脏0.9NaCL 6mL海砂 200mg在低温下研磨成浆用稀薄的脱脂棉过滤得提取液滤液不清。 2.转氨作用 取试管2支按下表加入试剂加入试剂的单位为mL 试 剂 对照管 测试管 1谷氨酸 0.50 0.50 1丙酮酸钠 0.50 0.50 0.1KHCO3 0.50 0.50 0.025一溴乙酸可不加 0.25 0.25 煮沸的酶液 0.50 酶液 0.50 加脱脂棉塞45水浴1.5h时时振荡内容物 2乙酸 6滴 6滴 沸水浴2min使蛋白质完全沉下过滤作层析 3.纸层析操作方法 取圆形层析滤纸1张在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆滤纸不可以折通过中心将滤纸绘成四等分扇形。用毛细管点样2-4次直径不超过2mm在滤纸的圆心上剪一小孔直径约1-2mm取一小滤纸条将下端剪成刷状在卷成灯芯插入圆形小孔不能使灯芯突出纸面将圆形滤纸平放在盛有层析液水饱和酚培养皿上使灯芯向下与溶剂接触用大小相同的培养皿盖在滤纸上溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止展层时间为1h80-100烘箱干燥喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液80-100显色。 三、实验结果 实验 血清谷丙转氨酶活力单位测定 一、实验原理 本实验用丙氨酸和-酮戊二酸为底物经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与24-二硝基苯肼作用生成24-二硝基苯腙此物质碱性条件下呈棕红色其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较即可计算出酶的活力单位。 二、实验试剂 11/15mol/L pH7.4的磷酸缓冲液取1/15 mol/L磷酸氢二钠称取Na2HPO4 9.47g或Na2HPO412H2O 23.87g溶于蒸馏水中定容至1000mL825mL1/15 mol/L磷酸二氢钾称取KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中定容1000mL175mL混合。 2GPT基质液称-酮戊二酸29.2mg2mol/L及-DL-丙氨酸1.78g200mol/L溶于50mLpH7.4的磷酸缓冲液中加0.1mol/L NaOH溶液0.5mL调pH为7.4然后加磷酸缓冲液定溶至100mL加少许氯仿防腐置冰箱中可保存一周。 31mmol/L 24-二硝基苯肼溶液称取24-二硝基苯肼20mg溶解于10mL浓盐酸中以蒸馏水定容至100mL。 42mol/mL丙酮酸钠标准液精确称取丙酮酸钠22mg加磷酸缓冲液溶解后定容至100mL。临用前配制。 50.4mol/LNaOH溶液 三、实验操作 一标准曲线的绘制 试管 试剂 测定管 空白管 1 2 3 4 5 2mol/mL丙酮酸钠标准液 mL 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 GPT基质液mL 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 pH7.4磷酸缓冲液mL 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 充分摇匀后置于37水浴保温10min 24-二硝基苯肼溶液mL 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 充分摇匀后置于37水浴保温20min 0.4mol/LNaOHmL 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 充分摇匀后室温静置30min后520nm波长下比色 A520nm值 相当丙酮酸含量mol 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 相当GPT单位100mL 100 200 300 400 500 以酶的活力单位数为横坐标以光吸收值为纵坐标绘制A520nm与对应的酶活力单位数的标准曲线。1丙酮酸钠标准液mL数摩尔浓度2mol/mL。2GPT活力单位为每mL血清在37与pH7.4的基质液作用60min生成1mol丙酮酸为一个单位U。本实验临床检验取血清量为0.1mL报告数据以100mL血清计算因此将实际测得结果1000即可。 二酶活力的测定 试管 试剂 对照管 测定管 0 1 GPT基质液mL 0.50 0.50 37水浴预温10min 血清mL 0.10 PH7.4磷酸缓冲液mL 0.10 0.00 充分摇匀后置于37水浴保温60min 24-二硝基苯肼mL 0.50 0.50 充分摇匀后置于37水浴保温20min 0.4mol/LNaOHmL 5.00 5.00 摇匀后静置30分钟520nm波长下比色。查标准曲线的对应值可得100mL血清中谷丙转氨酶的活力单位数 三实验结果 试 管 比色杯吸光值 吸光值 纯吸光值 对照管 测定管 查标准曲线得GTP单位 参考数值GTP单位 四注意事项 1. 所需试剂如基质液、丙酮酸标准液、24-二硝基苯肼等均需冷藏 2. 为防止溶血及其他因素对酶活性影响实验所用器皿应干净、干燥方可使用 3. 丙酮酸钠极易变质配试剂时应选择外观洁白干燥者否则应进行重结晶 4 .转氨酶只能用于-L-Ala对D-Ala无催化作用。实验室多用-L-Ala是因为便宜如果采用-L-Aa则用量需减半 5. 如活性高于500U/100mL应将血清稀释一定倍数重新测定结果应稀释倍数 6.为保证操作结果可靠测定酶活性时应恒定pH、保温时间 7.选用固定分光光度计及比色杯减少误差。 实验 GPT/ALT在临床诊断意义及检测方法原理 一、GPT/ALT在临床诊断中的意义 转氨酶广泛存在于机体的各个组织中在肝组织中谷丙转氨酶活性较高在心脏中谷草转氨酶活性较高。在正常新陈代谢中血清内维持一定水平的转氨酶活性即正常值。当组织发生病变时由于组织细胞肿胀、坏死或细胞膜破裂使细胞膜通透性增高而导致大量的酶释放至血液中从而引起血清中相应的谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著增高。因此测定其活性对肝、心脏的某些疾病的临床诊断具有重要的参考价值。 二、丙氨酸氨基转移酶试剂盒使用说明 1用途 本试剂用以测定人血清中丙氨酸氨基转移酶活力。 2基本原理 底物L-丙氨酸与-酮戊二酸在ALT作用下生成丙酮酸生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶作用下转化成L-乳酸同时伴随着NADH氧化引起在波长340nm处吸光度下降下降速率与血清ALT活力成正比。 L-丙氨酸 -酮戊二酸丙酮酸 L-谷氨酸 氨氨酸 NADH HL-乳酸 NAD H2O 3.试剂盒组成 试 剂 成 分 含 量 溶液A Tris缓冲液pH8.5 0.1mol NADH 0.30mmol LDH 5.0KU/L 溶液B Tris缓冲液pH7.0 0.1mol L-丙氨酸 1020mmol -酮戊二酸 36mmol 三、实验仪器 1.具有能在波长340nm处测定生化分析仪 2.30、37水浴箱 3.定时器 4.准确的加样器 四、操作方法 1.二步法 试 管 样本管 空白管 样 本 0.3mL 蒸馏水 0.3mL 溶液A 2.0mL 2.0mL 混匀、放设定温度5min 溶液B 1.0mL 1.0mL 混匀准确记录时间放设定温度1min后在波长340nm处以蒸馏水校零连续监测1-2min计算A/min。 2.一步法 试 管 样本管 空白管 样 本 0.3mL 蒸馏水 0.3mL 工作液 3.0mL 3.0mL 混匀准确记录时间放设定温度1min后在波长340nm处以蒸馏水校零连续监测1-2min计算A/min。 工作液制备溶液A与溶液B以2:1混合组成测定工作液。工作液在2-8避光保存可稳定3周。 五、实验结果 序号 1 2 3 4 吸光值 A/min 计算公式 计算结果 参考数值 六、注意事项 1.本液体试剂按IFCC推荐法为基础设计采用二步法可防止胆红素的干扰 2.试剂与样本量可按生化分析仪要求衡比例改变 3.本试剂线性可达到600 U/L30或1000 U/L37当样本中ALT活力超过600 U/L30或1000 U/L37时可用生理盐水稀释即0.1mL血清加0.2mL生理盐水测定结果3 4.如试剂变混或以蒸馏水为空白工作液在340nm处吸光度1.0请勿使用 5.贮存条件与有效期试剂在2-8避光保存有效期为1年如用一步法工作液在2-8避光保存可稳定3周。 实验 检测SGPT活性在科学研究中的应用 一、基本原理 测定SGPT活性可反映出肝细胞的坏死程度因此是检测肝功能损坏的灵敏指标之一。很多有毒物质易引起肝损伤造成肝实质细胞的变性及坏死例如四氯化碳CCl4等化学药物可以诱发动物发生急性中毒性肝炎和肝坏死。因此建立由CCl4诱发病变的动物模型然后检测SGPT活性常被用于滋肝补肾中草药物的筛选研究。 二、应用实例 红缘层孔菌多糖对CCl4中毒小鼠转氨酶SGPT活性的影响。 将体重20-22g小白鼠随机分为三组每组10只。第1组为正常对照第2组为四氯化碳中毒对照组第3组为给药组。 给药组以150mg/kg体重的剂量给小鼠灌胃红缘层孔菌多糖液每日一次连续给药7天其余两组灌胃同体积生理盐水。于末次给药后24h给药组、四氯化碳中毒对照组均按10mL/kg体重剂量腹腔注射0.1CCl4豆油溶液正常对照组注射