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微生物学基础知识微生物广泛地存在于自然界，与我们共同生活在这个世界上，影响着我们生产和生活的方方面面，微生物对于大多数人来说既熟悉又陌生。说熟悉，那是因为在我们的周围,如土壤、空气，直至我们身体无不存在着大量的微生物，我们所患的各种疾病如肝炎、痢疾、伤寒、肺炎、脑膜炎等无不与它们有关。在制药行业，GMP对厂房的洁净度有着较为苛刻的要求：在100级洁净度下每立方米空气中的浮游菌不得多于5个，沉降菌不得多于1个；大容量注射剂必须做无菌检查，固体制剂必须做微生物限度检查。不同的剂型不得检出相应的控制菌；在工艺用水中对细菌、霉菌、酵母菌也有要求。这些控制指标所针对的对象都是微生物。因此说，我们对它们是熟悉的。说到不熟悉，那是因为我们大多数人对它们缺乏较深入的了解，如它们的外观形态、内部结构是什么样的？它们的生化特点有哪些？它们对整个生态系统有着怎么样的功与过？它们对我们制药行业会带来哪些有益或有害的影响，我们对它们应该怎样加以利用或防范？所有这些，对大多数人来说是不了解的。因此说对它们是陌生的。以下对微生物的一些基本知识作一简要介绍。1、什么是微生物？ 微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。它们都是一些个体微小，结构简单的低等生物，包括原核类的细菌（真细菌）、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次体；属于真核类的真菌（酵母菌、霉菌和蕈菌）、原生动物和微藻类以及属于非细胞类的病毒和亚病毒。那什么是“原核类”和“真核类”呢？所谓原核，是指这类微生物的细胞中没有细胞核的结构，而且其它结构成份也比较简单；所谓真核，就是在它们细胞中有一明显的细胞核。它们在繁殖的方式上也有所区别。原核类微生物的繁殖靠细胞的一分为二、二分为四的分裂方式来实现，因此它们也被称为“裂殖菌；而真核微生物的繁殖方式比较复杂和多样，许多种类要通过不同细胞的交配，此外在细胞壁的结构上二者也有不同，有细胞壁的原核微生物其细胞壁的主要成份是一类含氨基酸的多糖，称肽聚糖；有细胞壁的真核生物其细胞壁中含有的主要成分是纤维素（例如高等植物细胞）或甲壳质（如霉菌）。在生物分类上，所有的原核细胞生物都是微生物，而真核生物中有微生物（如酵母菌和霉菌），亦有其它生物，如高等动、植物都是由真核细胞构成的。原核生物的细菌根据细胞壁中含肽聚糖的多少和厚薄可分为两类：一类是细胞壁含肽聚糖多而厚的细菌，用一种称为“革兰氏染色”的方法，可以将其染成蓝紫色，这类细菌被称为革兰氏阳性菌，以符号G+来表示，它们以球菌居多，包括少部分杆菌；另一类细胞壁含肽聚糖少而薄的细菌易被染成红色，这类细菌被称为革兰氏阴性细菌，常用符号G-表示，这类菌以杆菌居多，球菌居少。革兰氏染色法由丹麦医生CGram于1884年创立，是各类染色法中最为重要的一种。由于细菌体积小，细胞透明，不易观察，经染色后由于对比度的增加使得观察变为容易。 20世纪70年代后，科学家发现了另外一类既不同于原核也不同于真核的微生物，它们都生活在极端环境下，是地球上最古老的生命，有的已存在了30亿年，它们被称为古生细菌。由于古生菌的发现，现在地球上的生物被分成了三大类：细菌、古生细菌和真核生物。2、微生物的功与过： 这里所说的“功与过”是指对于人类的功与过，在一般人看来，只要是微生物，便是对人类有害的。其实不然，大多数微生物的“功”是大于“过”的。它们在地球上的物质循环和生态平衡方面是扮演着不可或缺的角色的。试想一下假如没有微生物，那么我们的地球是否早已为各种尸体所覆盖，是否早已垃圾遍地？在自然界的物质循环当中，将复杂的有机物变为简单的无机物，还原为可重复利用的无机离子，这一过程是离不开微生物的。可以说没有微生物作为大自然的“清道夫”，那么整个生物界的生存和进化也就停止了。更直观地说，人类自身的生活也离不开微生物。诸如在酿酒、食品加工、医疗制药、环境保护、生物技术等方面我们都和微生物有着密不可分、千丝万缕的联系。但问题的另一方面是，毕竟微生当中有些种类是对人类有害，或它们当中的某些种类在一定的条件下对人类有害，这就要求我们对它们不断地研究，不断加深认识，以图趋利避害。对制药行业而言，微生物毕竟是要严格防范和监控的指标。那么某些微生物对人类会带来哪些危害，或者通过哪些途径危害人类呢？3、微生物的致病性 我们将能入侵宿主，引起感染的微生物称之为“病原微生物”或“病原菌”，它们包括细菌、真菌、病毒等等。它们之所以能造成宿主感染，是因为它们能产生致病物质，而这种致病物质可分为毒素和侵袭力。毒素对宿主有毒，能直接破坏机体的结构和功能。侵袭力本身不具备毒性，但能突破宿主机体的生理防御屏障，使微生物在机体内生存下来（医学上称为定殖）、繁殖和扩散，是病原微生物侵入机体的一种能力。如果说把毒素当做“原凶”，那么侵袭力就是“帮凶”。毒素和侵袭力因细菌种类的不同，对人类所产生的危害程度也不同。 根据性质、作用和产生菌的不同，病原菌毒素分为外毒素和内毒素。它们的主要区别见下表： 表1 外毒素和内毒素的主要区别关于内毒素的内容将在下面章节中做专门介绍，这里着重介绍一下外毒素，所谓外毒素，即指细菌在进行新陈代谢过程中，在细胞内合成，然后分泌到菌体外的一种物质（亦有少数外毒素是活的细菌在体内合成后并不分泌到菌体外，而是保存在体内，等菌体死亡溶溃后才释放至周围环境中），它与内毒的区别之一即是，外毒素由活菌产生，而内毒是由死细菌细胞壁的分解而产生。外毒素是一类蛋白质，它们的毒性十分强大，最强的肉毒毒素1毫克纯品即能杀死2亿只小鼠，其毒性比化学毒剂氰化钾还要大1万倍。霍乱弧菌、痢疾杆菌和大肠杆菌能产生分泌到它们细胞外的肠毒素而引起患者腹泻；鼠疫杆菌分泌的鼠疫毒素作用于全身血管和淋巴，使其出血和坏死；破伤风杆菌能产生致人于死地的破伤风毒素；白喉棒状杆菌产生的白喉毒素特别喜欢结合在外周神经末稍、心肌等处，使受感染的细胞中蛋白的合成受到影响，从而导致外周神经麻痹和心肌炎等。4、正常菌群 除“病原菌”之外，还有一类细菌，它们平时能与宿主处于生态平衡状态，并不引起机体的感染，这时我们称它们为“非致病菌”。如大多种类的大肠埃希菌即是如此。但这种“非致病性”不是绝对的，一旦条件发生某些改变，如长期服用广谱抗生素造成了菌群失调，或宿主免疫机能下降，或菌群寄居部位发生了改变，这些“非致病菌”也会造成感染，此时它们即成为了“致病菌”，因此，我们可以称这些“正常菌群”或“非致病菌”为“条件性致病菌”或“机会性致病菌”。那么什么是“正常菌群”呢？正常菌群的概念是：在正常情况下，人体体表及与外界相通的腔道经常存在着对人的健康无损害的各种细菌，称为正常菌群或正常菌丛。这些细菌，有些只作暂时停留；而有些由于与人类长期互相适应以后，形成终生的共生关系。正常菌群的生理意义在于：正常菌群不仅与人体保持平衡关系，而且菌群之间也相互制约，以维持相对的平衡。在这种状态下，正常菌群发挥其营养、拮抗和免疫等生理作用。现将这几个功能简介如下：1）营养作用：正常菌群的存在，影响着生物体的物质代谢与转化。如蛋白质、碳水化合物、脂肪及维生素的合成，胆汁、胆固醇的代谢及激素转化等都有正常菌群的参与。2）拮抗作用：正常菌群在生物体的特定部位生长后，对其它的菌群有着生物拮抗的作用。产生这种生物屏障的往往是一些厌氧菌。正常菌群通过紧密与粘膜上皮细胞结合来占领位置，由于它们在这些部位的数量很大，在营养竞争中处于优势，并通过自身的代谢来改变环境的PH值或释放抗生素，而抑制外来菌的生长。3）免疫作用：正常菌群的抗原刺激可使宿主产生免疫，从而减少了本身危害，已有实验表明，某些诱发的自身免疫过程具有抑癌作用。 不难看出，正常菌群在维护人的健康和正常生命活动中是扮演着多么重要的角色。 正常菌群的病理意义：当某些因素破坏了人体正常菌群的平衡时，正常菌群中各种细菌的数量和比例也会跟着发生变化，这种情况被称作“菌群失调”。如果“菌群失调”没有得到有效的控制而出现临床症状，引起“二重感染”即被称作“菌群失调症”。5.细菌细胞的形态构造及功能：1)、形态：形态简单，基本上只有三种类型，即：球状、杆状和螺旋状； （1）球菌：根据其分裂方向可分为：单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌和葡萄球菌。（2） 杆菌：可分为：单杆菌、双杆菌、链杆菌。（3） 螺旋菌：根据弯曲程度分为：弧菌（2-6个弯）、螺菌（6个以上弯）。 在自然界中，杆菌最为常见。此外，近年来还陆续发现其它形态的细菌。如：柄杆菌（形状不规则，有柄、菌丝和附器等）、球衣菌（能形成衣鞘）等。大小：一般以um计。如Ecoli为2um0.5um，1500个头尾相连才3mm，120个肩并肩象头发丝大小。细菌的形态受环境条件的影响，如培养时间、温度、培养基的组成与浓度等均能引起细菌形态的改变。2)细菌细胞的构造：一般构造：（1） 细胞壁：功能：固定细胞外形；协助鞭毛运动；保护细胞免受损伤；是正常细胞的必需成分；阻碍有害物质进入细胞（大于800的抗生素）；与细菌的抗原性致病性和对噬菌体的敏感性有关。 细胞壁构造：(2） 细胞膜与间体： 位于细胞壁内，电镜下观察呈现液态镶嵌模型结构。细胞膜的功能： 控制细胞内外物质运送、交换。 维持细胞内正常渗透压。 合成细胞壁组分的场所和合成荚膜。 进行氧化磷酸化或光合磷酸化的产能基地。 鞭毛的着生点和为其提供能量。什么是间体：细胞膜向内凹陷形成的一种管状、层状或囊状结构，一般位于细胞分裂部位或其临近。功能：促进细胞间隔的形成并与遗传物质的复制及其相互分离有关。在G+性菌中间体比较明显。细胞质：细胞膜以内除核质体外的一切透明、胶状、颗粒状物质总称细胞质。其主要成分为：核糖体、，贮藏物、各种酶、中间代谢物、无机盐、质粒、少数细菌细胞还有伴孢晶体和气泡等。细菌细胞的特殊结构： 不是所有细菌都有的，主要包括糖被、鞭毛、菌毛和芽孢。（1）糖被：是某些细菌细胞壁外附着的一层厚度不定的胶状物质。根据厚度不同可分成：微荚膜、荚膜、粘液层。主要成分：多糖、多肽、蛋白质。作用：保护细菌免受干旱损伤，对致病菌来说可保护他们免受宿主白细胞的吞噬。贮存养料，以备营养缺乏时用。堆积某些代谢废物。通过荚膜使菌体附着在物体表面。细菌间的信息识别作用。与生产关系：可产生很多工业产品，利用肠膜明串珠菌荚膜提取聚葡萄糖制备代血浆或葡萄糖凝胶试剂。用甘蓝黑腐病黄单孢菌的荚膜生产黄原胶，可用于石油开采中钻井液添加剂，也可用于印刷、食品等。有些还可于污水处理。破坏作用：有些细胞的荚膜能使糖液、酒、奶、面包等食品发粘变质；增加某些致病菌的致病力等。（2） 鞭毛和菌毛： 鞭毛：某些细菌体表着生的丝状、波状附属物，一般有1-数十根,鞭毛是细菌的运动器官，且运动速度很高，20-80um/S。也是菌种分类鉴定中的重要指标。 菌毛：（纤毛、伞毛、绒毛、须毛）是长在细菌体表的一种纤细（直径7-9nm）、中空（直径2-2.5nm）短直、数量较多（250-300）的蛋白质附属物，一般多见于G-中，功能是使细菌较牢固地粘连在物体（呼吸道、消化道、泌尿生殖道粘膜）上。大部分为致病菌。性菌毛：是一种特殊的菌毛，比菌毛稍长，每个细胞有1-4根；其功能是在不同性别的菌株间传递DNA片段；多存于G-中。芽孢：某些细菌在其生长发育后期，可在细胞内形成一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体，称为-芽孢。 特性：具有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压的能力。肉毒梭菌芽孢在100水中，可存活5-9.5小时。121，可存活10min。芽孢的构造： 芽孢抗紫外线的能力，比其营养细胞强1-数十倍，芽孢的休眠能力是十分惊人的，在休眠时不能检出任何代谢能力，因此又称“隐生态”。芽孢在普通状态下可保存几年到几十年，德国的几个植物标本上曾分离到200-300年的枯草芽孢杆菌的芽孢。有些湖底沉积土中的芽孢杆菌经500-1000年仍有活力，甚至有存活2000年的记载。 能产生芽孢的细菌种类并不多，主要是G+杆菌，即芽孢杆菌科的两个属（好氧性的芽孢杆菌属和厌氧性的梭菌属）。 6.细菌群体（菌落）的形态：菌落：是由单个细菌细胞经生长繁殖而成的肉眼可见的子细胞群体。菌苔：多个菌落融合到一起形成- 菌落的形成有种的稳定性和专一性，因此可用于微生物的分离、纯化、鉴定、计数、选种和育种工作中。菌落在固体培养基上形态的描述：大小、形状、隆起度、边缘、表面状态（光滑、皱褶等）、表面光泽、表面质地（油脂状、湿润）、颜色及透明度。 液体培养基中的状态描述：有无混浊、颜色改变否、沉淀否、有无气泡、菌环等。7、大肠埃希菌和大肠菌群 根据常识，大肠埃希菌是与人类共生的主要菌种，亦是人体正常菌群的主要菌种，那么为什么还规定“不得检出”呢？大肠埃希菌与“大肠菌群”又是一种什么关系呢？大肠埃希氏菌（EColi）通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，它在生物学的分类是：细菌域（界）、变形菌门、r-变形菌纲、肠杆菌目、杆菌科、埃希氏菌属、大肠杆菌种，周身鞭毛，能运动、无芽孢、能发酵多种糖类、产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌。其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物的生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常条件下不致病，但若进入胆囊、膀胱等处则引起炎症。而这个菌种中的0157：H7血清型，属肠出血性大肠杆菌，可引起肠出血性腹泻，约2%7%的病人发展成溶血性尿毒综合征。注射液中细菌内毒素的主要来源即是由于大肠杆菌的污染。 所谓“大肠菌群”并非细菌分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特征的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧兼性厌氧，在37能分解乳糖产酸、产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，一般认为该菌群包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于恒温动物粪便，人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方。人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主。而外界环境中则以大肠菌群其它型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品、药品中是否有粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者粪便，所以粪便内除一般正常菌外，同时也会有些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而如食品药品中有粪便污染，则可以推测该食品药品存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看做对健康具有潜在的危险性。 当然，在固体制剂中大肠菌群的检出，只是标示着有粪便污染的可能性，在一定数值之内还是能够容忍的，但一旦确定其中确有大肠杆菌的存在，那么食品或药品就确遭粪便污染无疑。 而对于大容量注射剂来说，必须做无菌检查（样品接种后，必须连续观察14天），只要样品中微生物生长，该批产品就判为不合格，必须报废，否则将招致严重后果。8、什么是内毒素？ 内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分脂多糖。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏细菌后才释放出来。它的化学性质十分稳定，在100高温加热1小时不会被破坏，只有在160的温度下加热24小时，或用强酸、强磁、强氧化剂加温煮沸30分钟，才能破坏其生物活性。此外一般的滤器不能将其滤除，但可被活性炭所吸附。关于它和外毒素的区别已在前面有叙述。这里仅其对人体的危害作一简略介绍。 1）发热反应：人体对细菌内毒素极为敏感。极微量（15ng/公斤体重）内毒素就能引起体温上升，发热反应持续约4小时后逐渐消退。自然感染时，因革兰氏阴性菌不断生长繁殖，同时伴有陆续死亡，放出内毒素，致发热反应将持续至体内病原菌完全消灭为止。内毒素引起的发热反应的原因是：内毒素作用体内的巨噬细胞等，使之产生白细胞介毒1、6和肿瘤坏死因子a等细胞因子，这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体温升高发热。在发热的同时常伴有中性粒细胞的升高。 2）内毒素休克：大量内毒素进入血液，可发生内毒素血症。大量内毒素作用于机体巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、血小板以及补体系统和凝血系统等，便会产生白细胞介素，缓激肽等生物活性物质。这些物质作用于小血管，造成功能紊乱而导致微循环障碍，临床表现微循环衰竭，低血压、缺氧、酸中毒等而导致病人休克，这种病理反应叫做内毒休克。一旦发生内毒素休克，若抢救不及时或方法不当将造成患者死亡。 综上所述，无论微生物在宏观上对人类如何功大于过，但对于制药行业而言，尤其针对我们公司产品品种，它们是必须加以严格监控的目标。如不注意，轻者，固体制剂中微生物超标，药品成了疾病的传染源，这样我们