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第三章 DNA复制 DNAReplication 第一节 DNA的半保留复制 DNA在复制过程中首先两条亲本链之间的氢键断裂 双链分开 然后以每条亲本链 parentalstrand 为模板 按碱基互补配对原则 A T G C 由DNA聚合酶催化合成新的互补子链 daughterstrand 复制结束后 每个子代DNA的一条链来自亲代DNA 另一条链则是新合成的 并且 新形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同 这种复制方式称为半保留复制 semiconservativereplication 一 复制起点与复制子 Replicon 作为一个单位进行复制的任何一段DNA序列 它含有一个复制起点 有时还含有一个复制终点 Origin 是复制子起始复制的一段DNA序列 第二节 DNA的复制起点和复制方式 作为一个单位进行复制的任何一段DNA序列 复制子的复制通常从一个固定的位点开始的 这种起始DNA复制的序列叫做复制起点 DNA复制时 双螺旋的两条链在复制起点处分开形成两条模板链 一旦复制开始 就会在DNA分子上形成两个复制叉 replicationfork 复制叉向着未复制的区域沿着DNA相向移动 因此复制是双向的 所有的原核生物的染色体 很多噬菌体和病毒的DNA分子是环状的 它们作为单个复制子完成复制 真核生物染色体的线状DNA则含有多个复制子 每一个复制子都有自己的复制起点 一个典型的哺乳动物细胞有50000 100000个复制子 复制子的长度为40 200Kb 正在复制的真核生物基因组DNA分子上 会形成许多复制泡 随着复制叉沿着DNA分子向两个方向移动 复制泡不断变大 最终 两个相邻复制泡的复制叉会相遇 融合 完成DNA的复制 在复制叉处 DNA的两条链都作为模板同时合成两条新链 DNA分子的两条链是反向平行的 而DNA复制时无论以那条链做模板 新合成的链是按5 3 方向进行的 所以只有一条模板链指导合成的新生链能够沿着复制叉运动的方向连续复制 此新合成的链称为前导链 leadingstrand 另一条模板链指导合成的新生链也是沿5 3 方向进行 但与复制叉前进的方向相反 是分段合成的 这些片断于1969年首先在大肠杆菌中分离出来 被称为冈崎片段 二 DNA的半不连续复制与DNA的引发 在细菌中冈崎片段长约1000 2000核苷酸 但在真核生物中 相应片断的长度可能短得多 由100 400个核苷酸组成 合成的片段即为冈崎片段 这些冈崎片段以后由DNA连接酶连成完整的DNA链 因此冈崎片段是DNA复制中短暂的中间产物 这条链不连续合成的链称为滞后链 laggingstrand 这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是普遍存在的 称为DNA合成的半不连续复制 目前已知的DNA聚合酶都只能延伸已经存在的DNA链 而不能从头启动DNA链的合成 这是因为它在合成DNA时需要一个自由的3 OH 那么一个新的DNA链的合成是如何开始的呢 研究发现 DNA复制时还需要另外一种酶来合成一段RNA作为合成DNA的引物 在细菌中 引物合成依靠引物酶 primase 它是一种与转录酶不相关的RNA聚合酶 三 滚环复制与D环复制 1 滚环复制 环状DNA分子除了能够进行 型复制外 还能进行滚环复制 在进行滚环复制时 首先在双链环状DNA分子一条链的特定位点上产生一个切口 切口的3 OH末端围绕着另一条环状模板被DNA聚合酶延伸 随着新生链的延伸 旧链不断地被置换出来 因此整个结构看起来像一个滚环 某些噬菌体DNA和质粒DNA是以滚环的方式进行复制的 2 D环复制 叶绿体和线粒体DNA采用的是D环复制 动物细胞的线粒体DNA为双链环状DNA DNA两条链的密度并不相同 一条链因富含G而具有较高的密度 所以被称为重链 heavystrand Hstrand 另一条链因富含C而具有较低的密度 因而被称为轻链 lightstrand Lstrand 线粒体DNA的复制是非对称的 每一个DNA分子有两个相距很远的复制起始区 OH和OL OH用于H链的合成 OL用于L链的合成 两条链的合成都需要先合成RNA引物 但都是连续合成的 第二节 细菌DNA复制 一 复制的起始 该序列含有两个短的重复基序 两个基序的长度分别为9bp和13bp 9bp基序共有4个拷贝 分散于整个OriC的范围内 它是DnaA蛋白的结合位点 通过DnaA蛋白与OriC的相互作用以及DnaA蛋白之间的相互作用 大约30个DnaA蛋白结合在复制起始区 这种结合只能发生在负超螺旋DNA分子上 而负超螺旋是大肠杆菌染色体的正常存在状态 DNA分子在DnaA蛋白复合体上的缠绕 导致双螺旋在串连排列的3个富含AT的13bp基序处解开 一般认为螺旋解开是由于DNA双螺旋在DnaA蛋白复合体上缠绕后产生的扭转张力的结果 DNA双螺旋的进一步打开需要DnaB蛋白 DnaB蛋白是解旋酶 Helicase 其作用是解开DNA双链 接着单链结合蛋白 single strandedbindingprotein SSB 与解旋酶解开的单链结合 其作用是防止单链降解 阻止单链退火 二 Elongation 一旦复制起始 复制叉就沿着DNA分子前进 合成与亲本链互补的两条新DNA链 新生链的合成由DNA聚合酶催化完成 从大肠杆菌细胞中分离出了5种DNA聚合酶 DNA聚合酶III是大肠杆菌DNA复制中链延伸反应的主要聚合酶 DNA聚合酶I专门用于RNA引物的去除 另外3种DNA聚合酶主要参与DNA修复和跨损伤合成 1 DNA聚合酶I DNApolI由一条多肽链组成 分子量为109KD 酶分子中含有一个Zn2 是聚合酶活性必需的 用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水解成两个片段 大片段的分子量为76KD 通常称为klenow片段 小片段为34KD 大小片段具有不同的酶活性 1 DNA聚合酶的5 3 聚合活性 这是DNA聚合酶最主要的活性 按模板DNA上的核苷酸顺序 将互补的dNTP逐个加到引物RNA3 OH末端 即促进3 OH与dNTP的5 PO4形成磷酸二酯键 酶的专一性表现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对时才有催化作用 5 3 聚合活性存在于klenow片段上 2 DNA聚合酶的3 5 外切核酸酶 exonuclease 活性 这种酶活性的主要功能是从3 5 方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对的核苷酸 这种功能称为校对功能 proofreading 这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的 因此对于维持DNA复制的真实性 replicationalfidelity 至关重要 ProofreadingbyDNApolymerase 3 DNA聚合酶的5 3 外切核酸酶活性 这种酶活性是从DNA链的5 端向3 末端水解已配对的核苷酸 本质是切断磷酸二酯键 每次能切除10个核苷酸 因此 这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起重要作用 对完成的DNA片段去除5 端的RNA引物也是必须的 DNApol 的5 3 聚合活性和5 3 外切酶活性协同作用 可以使DNA一条链上的切口从5 3 方向移动 这种反应叫做缺刻平移 nicktranslation 2 DNAPolymeraseIII DNA聚合酶III DNA聚合酶III由10个不同的亚基构成 其中 和 亚基构成核心酶 亚基具有5 3 聚合酶活性 亚基具有3 5 外切活性 亚基功能尚不清楚 可能仅仅起结构上的作用 使两个核心亚基以及其他各辅助亚基装备在一起 DNA聚合酶III具有两个拷贝的核心酶 两个拷贝的 亚基围绕DNA双螺旋形成一个环状的二聚体 一旦 亚基二聚体与DNA紧密结合 它的作用就像一个 滑动夹子 slidingclamp 携带着核心聚合酶沿着DNA链自由滑动 BetaformsadonutshapedringaroundtheDNAandhelpstoanchortheholoenzymetotheDNAduringreplication Byactingasasliding clamp betahelpstheholoenzymetoreplicatelongstretchesofDNAwithout fallingoff thestrand thisiscalledprocessivity 聚合酶的第3个组成部分是由5个亚基构成的一个所谓的 复合体 复合体又称夹子装载因子 clamploader 催化滑动夹打开 并将其结合在引物 模板上 介导 亚基与模板 引物双螺旋的结合 最后 两个拷贝的 亚基使核心聚合酶形成二聚体 3 在复制叉处先导链和后随链的合成同时进行 RNA引物合成以后 DNA的延伸过程便开始了 先导链被连续合成 而后随链是不连续合成的 在复制叉上 DNA解旋酶在后随链模板上沿着5 3 运动 DNA聚合酶III全酶通过 亚基和解旋酶相互作用 两个 亚基分别与一个核心酶结合 其中一个核心酶复制前导链 另一个核心酶复制后随链 DNA引物酶周期性地与DNA解旋酶结合 并在后随链模板上合成新的引物 当负责后随链合成的核心酶完成一个冈崎片段的合成后 即从滑动夹和DNA上脱落下来 随后 DNA聚合酶III的滑动夹装载因子在新形成的模板接头位置上 组装新的滑动夹 新组装的滑动夹与核心酶结合 起始下一个冈崎片段的合成 新合成的冈崎片段与上一个冈崎片段被一切口分开 冈崎片段的RNA引物长约5个核苷酸 而它的DNA部分长约1000 2000bp DNA聚合酶I与切口结合 并利用其5 3 外切酶活性切去下游冈崎片断的RNA部分 与此同时上游的冈崎片断 这一过程相当于切口平移 当RNA引物被切除后 由DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成 从而把冈崎片断连接起来形成连续的不含RNA序列的后随链 三 Terminationandsegregation 细菌基因组的复制是从单一位点双向进行的 大肠杆菌的复制终止区域位于环状染色体上与复制起点相对的一侧 在这一区域存在若干个终止位点 Ter Ter序列按照特定的方向排列在染色体上 图 制造了一个 陷阱 复制叉可以进入该区域 但不能出去 原因是Ter位点只在一个方向上发挥作用 当序列特异性DNA结合蛋白Tus与终止位点结合后 只阻断一个方向上的复制叉的前进 而对向另一个方向前进的 复制叉不起作用 例如 TerB阻断顺时针方向复制叉 TerA阻止逆时针方向复制叉 终止区这样的安排可确保两个从相反方向进入ter区的复制叉总能相遇 当一个复制叉遇到另一个复制叉时 DNA复制就完成了 四 复制起始调控 大肠杆菌染色体DNA的oriC含有11个拷贝的GATC序列 在DNA复制之前 染色体DNA上的每一GATC序列 包括oriC区域中的GATC 都被甲基化 新复制的GATC位点呈半甲基化状态 即旧链是甲基化的 但新链尚未被甲基化 新复制 半甲基化的oriC可被SeqA蛋白识别 SeqA与半甲基化的GATC紧密结合 SeqA的结合出现了两个结果 首先它极大地降低了与之结合的GATC序列的甲基化速率 其次阻止了DnaA蛋白与复制起点的结合 当SeqA偶尔从GATC位点上脱离时 序列即被DNA甲基转移酶完全甲基化 防止了SeqA的重新结合 当GATC被完全甲基化之后 DnaA蛋白能进行结合并指导新一轮DNA的复制 一 复制起点与起始 真核生物的DNA复制发生在S期 在真核生物的基因组中 并非所有的复制子都同时进行DNA复制 而是按一定的顺序分批进行 构成常染色质的DNA在S期的早期复制 异染色质DNA主要在S期晚期复制 着丝粒DNA和端粒DNA复制时间最晚 现在尚不清楚控制复制早迟的分子机制 第三节真核生物DNA的复制 在真核生物中复制起始区有没有特殊序列呢 同研究大肠杆菌的oriC序列一样 通过把酿酒酵母基因组DNA片断插入到无复制功能的质粒中 找到了能够使重组DNA分子在酵母细胞中自主复制的酵母基因组顺序 这些酵母染色体的复制起点就被称为自主复制顺序 autonomouslyreplicatingsequences 或叫ARS元件 像所有的真核生物的染色体一样 每一酵母染色体含有多个复制起点 在酿酒酵母的17个染色体中 大约有400个复制起点 其中一些已经被仔细地研究过 利用突变分析 在一个 180bp的ARS ARS1 中鉴定出了一个复制起始必需元件 15bp的元件A 和另外三个能够提高起始效率的短片断 分别称为B1 B2和B3 比较一下酵母中多种ARS元件可发现有11bp的一致顺序 A T TTTAT A G TTT A T 元件A有10个位置上的碱基与一致序列相同 元件B2有9个位置上的碱基与一致序列一样 在酵母细胞中 一个由6种不同的蛋白质构成的复合物 起始位点识别复合物 originrecognitioncomplex ORC 专一性地与ARS1的元件A结合 这种复合体也专一性地结合于其他被研究过的ARS上 ORC与复制起点的结合很紧密 在整个细胞周期中 ORC一直保持着与ARS的结合状态 在G1期的早期 ORC募集Cdc6和Mcm形成前复制复合体 pre replicativecomplex pre RC 在细胞周期的大部分时间 Cdc6的浓度很低 但是在G1期的早期Cdc6的浓度短暂升高 并与复制起始位点上的ORC结合 Cdc6又募集Mcm蛋白形成前复制起始复合体 Mcm是一种6聚体的DNA解旋酶 Cdc6为解旋酶装载因子 一旦前复制复合体被装配成功 细胞便为DNA复制的起始做好了准备 当细胞通过了R点或START点 S Cdk的活性迅速升高 使DNA分子开始复制 二 复制叉 SV40的DNA为一5Kb的双链环状DNA 进入细胞核后会形成核小体 SV40DNA为研究哺乳动物的复制叉提供了非常好的模型 与大肠杆菌的复制起始过程一样 SV40DNA的复制也发生在一个特定的位点上 病毒编码的T抗原是一种位点专一性DNA结合蛋白 它与SV40DNA的复制起点结合 利用解旋酶活性局部打开DNA双螺旋 DNA双螺旋的打开还需要ATP和复制蛋白A replicationproteinA RPA 的参与 RPA实际上是一种宿主细胞编码的单链结合蛋白 在真核细胞中 引发酶与DNA聚合酶 形成一个复合物 这个复合物在复制起点与单链模板结合 并合成大约10个核苷酸长的RNA引物 接着 RNA引物要被DNA聚合酶 延伸一小段距离 因为DNAPol 引物酶的延伸能力相对较低 很快就被高延伸性的DNA聚合酶 或聚合酶 取代 聚会酶 或聚合酶 取代DNAPol 引物酶的过程称作聚合酶切换 polymeraseswitching 发生聚合酶切换时 细胞复制C replicationfactorC RFC 结合到延长的引物上 催化装配