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Cold-PCR临床实用性分析Cold pcr原理 由于单核苷酸的错配会稍微地改变双链DNA的溶解温度，因此序列的改变或位置的错配会使大部分200bp或以上的序列的溶解温度有0.2-1.5 C的轻微改变 作者的实验方案就是利用了以下两点：1. 每一双链DNA都有一个比溶解温度低的关键温度，2. 关键温度取决于DNA序列，如果PCR的变性步骤是在关键温度下进行，那么只要两个模板DNA的序列稍稍有一两个核苷酸的不匹配就会使扩增效率有很大的改变实验过程在了解这原理的基础上作者设计了以下的一般过程1. 变性阶段 DNA在高温下变性，通常是94(201F)2. 调节退火阶段 设定一个调节退火温度使突变基因链和野生型基因链杂交。由于突变基因链在DNA混合液中数量较少，所以更容易和野生型基因链形成异源双链核酸3. 熔解阶段 在更低的温度下，这些异源双链核酸将更稳定地熔解。因此在关键温度下，他们选择性地变性4. 引物退火阶段 人双链DNA将优先保留双链结构而不进行引物退火。5. 延伸阶段 DNA聚合酶将沿着模板链按碱基互补配对原则延伸。由于异源双链核酸被用作模板，更大比例的低变异DNA将被扩增，同时在PCR结果环节可被用到Cold PCR两种模式FULL COLD PCR FULL COLD PCR的实验步骤是和上面的实验过程一致的。FAST COLD PCRFAST COLD PCR和FULL COLD PCR的区别是变性和调节退火阶段都被跳过了。这是因为有些时候，变异DNA的优先扩增已经很好了，以致不需保证异源双链核酸结构的形成问题。因此变性能在关键温度下发生，并进行引物退火和聚合酶调节延伸。每个扩增过程都包括这三步骤。通过利用更低的变性温度，反应将在更低的熔解温度下朝突变基因产物进行。对于在DNA混合液中扩增所有可能的变异，FULL COLD PCR是必不可少的Two-round COLD-PCR 是FAST COLD PCR的修正版，在FAST COLD PCR的第二步中，应用包被的引物。因此和one-round Fast COLD-PCR相比，Two-round COLD-PCR对突变基因的检测灵敏度有很大的提高COLD PCR优点：1无论是突变基因改变的是类型还是位置，一步法就能扩增已知的和未知的量少的等位基因2 不需要任何的试剂和器械，因此开支不会增加3 在一个混合样品中检测突变基因的效果比传统PCR好4 和传统PCR相比，实验的使用时间不会增加很多缺点：1. 必须测定每个外显子的最佳关键温度，并在传统PCR步骤的基础上额外增加一步反应2. 在PCR过程中，变性温度控制的准确性要求在+0.3以内3. 因为突变DNA和野生型DNA的关键温度可能不同，因此适合他们的关键温度可能不存在4. 对于分析小于200bp左右的序列有限制，效果不佳5. 容易出现聚合酶引导错误6. 所有各类突变的富集有赖于DNA
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