血小板源性生长因子BB表达对促进大鼠肌腱愈合和防止肌腱粘连的作用.doc

血小板源性生长因子BB表达对促进大鼠肌腱愈合和防止肌腱粘连的作用南京大学医学院附属鼓楼医院 林 樾 梁红伟 李云剑 燕 辛 谭 谦【摘要】目的 研究血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）基因转染大鼠肌腱细胞后促进肌腱愈合及防止肌腱粘连的作用。 方法 90只大鼠随机分为A、B、C三组，建立跟腱损伤模型。A组：实验组，肌腱断端注射PDGF-BB基因转染的肌腱细胞；B组：对照组，肌腱断端注射肌腱细胞；C组：空白对照组。6-0丝线行改良Kessler法缝合跟腱，管型石膏固定一周。术后第3d、1w、2w、4w、8w取样，分别行大体、组织学观察、力学以及免疫学检测，对比肌腱粘连度、组织中成纤维细胞数量、胶原纤维含量、肌腱最大抗拉力及最大滑动距离、组织中PDGF-BB的浓度。结果 PDGF-BB基因转染肌腱细胞经过RT-PCR以及测序证实在体外稳定表达。实验组在肌腱粘连度、胶原纤维数量、成纤维细胞数量、肌腱最大滑动距离以及组织中PDGF-BB含量等方面均优于对照组（P0.05或P0.05)。结论 运用PDGF-BB基因转染肌腱细胞注射有促进肌腱内源性愈合、减轻肌腱粘连的作用。【关键词】PDGF-BB基因；肌腱愈合；肌腱粘连；基因转染【Abstract】Objective To study the effect of platelet-derived growth factor-BB（PDGF-BB）gene expression in the process of promoting rat tendon healing and preventing adhesion of rat tendon.Methods 90 rats were randomly divided into three groups (gorup A、B and C), established tendon injury models. Group A: injected PDGF-BB gene transfected rat tendon cells in the end of injury tendon; Group B: injected tendon cells; Group C: control. Then samples were taken from rats tendons in different times including 3 days,1 week,2 weeks,4 weeks and 8 weeks after operation. Morphology and histology observation、mechanical testing and immunoassay were given. The effect of PDGF-BB gene transfected rat tendon cells in the process of promoting tendon healing and preventing adhesion of tendons were proved by comparing of the degree of tendon adhesion ;The number of tissue fibroblasts and collagen fiber content; tendon maximum tensile strength and the maximum sliding distance after the tendon healing ; levels of PDGF-BB in tendon tissue as well.Results The transfection of PDGF-BB gene into tendon cells were testified by RT-PCR and sequencing, and PDGF-BB could stably expressed in vitro. Compared with control, the PDGF-BB gene transfected rat tendon cells had more advantages in the degree of tendon adhesion; The number of tissue fibroblasts and collagen fibers; the maximum sliding distance and the content of PDGF-BB in tendon tissue（P0.05 or P0.05)(表1)。图1 RT-PCR检测PDGF-BB mRNA 的表达：1. marker 2.转染组RT-PCR3.转染组-actin RT-PCR 4.未转染组RT-PCR 5.未转染组-actin RT-PCR表1术后8周各组肌腱粘连程度分级(n=10)组别肌腱粘连分级级级级级级A组01231B组11233C组012253.组织学观察： 术后3天各组肌腱断端均可见充血水肿及炎细胞浸润；术后1周，充血、水肿较术后3天有所减少，同时胶原纤维增生，炎性细胞向胶原纤维浸润，并见吞噬细胞活跃；腱周组织可见毛细血管增生、成纤维细胞增殖活跃，其中以C组最明显；A组细胞数量相对较少（P0.05），而B、C组近断端的腱实质内可见较多成纤维细胞增殖，断端有新生胶原形成，并出现较多的新生毛细血管。术后2-4周，各组肌腱的炎性反应逐渐消退，成纤维细胞增殖活跃并向肌腱断端迁移，可见排列紊乱的胶原成分和毛细血管增生。术后8 周, 各组成纤维细胞数较前明显减少，组间数量趋于一致。肌腱断端胶原纤维的排列方向趋于一致，与肌腱纵轴平行，肌腱与周围组织的粘连较前减轻。愈合过程中B、C组各部位的成纤维细胞及胶原纤维含量均较A组多（P0.05），肌腱粘连也较重(图2、3，表2，3)。 图2各组肌腱HE染色粘连度观察100：A组PDGF-BB转染组，B组未转染细胞组，C组对照组图3各组肌腱Masson染色胶原纤维含量观察100：A组PDGF-BB转染组，B组未转染细胞组，C组对照组表2各组各时间点成纤维细胞计数（个）（）术后3天术后1周术后2周术后4周术后8周A组153.218.4a145.019.6ab130.220.0ab117.916.5ab98.513.8abB组170.425.7165.324.1b160.115.2b163.720.5b149.216.0bC组192.123.2a187.219.3a180.524.1a163.123.9a158.019.3a注：表中数据为单位面积内成纤维细胞计数，A组为实验组，与对照组相比aP0.01,与肌腱细胞组对比bP0.05表3各组各时间点胶原纤维含量（%）（）术后4周术后8周A组43.465.69ab46.455.01abB组55.327.85b53.378.23bC组61.048.46a59.387.94a 注：表中数据为单位面积内胶原纤维染色面积所占百分比，A组为实验组，与对照组相比aP0.01,与肌腱细胞组对比bP0.054生物力学测定A组肌腱愈合后,滑动距离与其他两组相比有显著增加（P0.01）。同组术后四周与八周相比，由于愈合后的功能重建等作用，粘连较第四周时有所好转（P0.05），对照组由于粘连较重，肌腱断端虽已愈合，但局部增粗，与腱周组织粘连严重。导致其抗拉力增加(表4)。表4各组生物力学测定（）滑动距离（mm）最大抗拉力（N）4周8周4周8周A组3.250.33abc3.650.21abc79.0311.40de81.1813.73deB组2.290.40b2.210.37b75.8815.07e78.409.58eC组 2.010.23a1.890.24a85.0315.19d86.3310.92d注：表中数据为最大滑动距离（毫米）和最大抗拉力（牛顿）A组为实验组，与其他两组相比a、b、cP0.055免疫学检测PDGF-BB在肌腱组织中浓度检测 Elisa检测结果表明，各组标本中，随时间推移，其PDGF-BB的量均逐渐下降，但仍明显高于B、C两组，至第8周时，A组与B两组之间PDGF-BB含量已无明显差异（P0.05）。但仍略高于C组（P0.05）（表5）。表5各组肌腱组织中PDGF-BB浓度（ng/ml）（）第3天第1周第2周第4周第8周A组12.951.3614.231.278.320.949.101.062.630.31abB组1.130.21-2.070.483.850.392.720.26bC组-1.630.36-2.250.44a注：表中数据为肌腱组织中PDGF-BB浓度A组为实验组，与其他两组相比aP0.05讨论在肌腱的自然修复过程中，内源性机制常常延迟【2】，外源性的修复占主导地位。为了达到短时间内增加肌腱自身强度并尽可能减少周围组织的增生的目的，只有通过增强肌腱的内源性愈合来实现，加快肌腱细胞自身的增殖，促进肌腱I型胶原蛋白的生成。PDGF-BB能够促进细胞的有丝分裂，对包括肌腱细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞都有促进其生长的作用，同时还可以加速胶原蛋白的合成【3、4】，尤其是I型及型胶原蛋白。而I型胶原蛋白正是在肌腱中表达最为丰富的蛋白。生长因子直接应用容易被体内蛋白水解酶所破坏,半衰期短，因此体内使用外源性生长因子常因水解而失活, 需不断给药才能发挥较好的效果, 但目前生长因子获得困难，难以广泛应用于临床，且外源性给药无法控制局部药物浓度及持续时间，靶向性较差。PDGF-BB是以一种剂量依赖的方式刺激DNA和细胞外基质的合成，只有一定浓度范围的该生长因子，才能发挥促肌腱细胞增殖的最大作用【5】，这使的PDGF-BB在体内的使用受到限制。基因转染是将目的基因通过分子生物学方法转染进正常组织细胞，并在正常组织细胞中获得表达的一种技术。它可以在靶区域长期稳定的表达目的蛋白，从而达到其他手段所不能达到的效果。Sabine【6】等通过将PDGF转染入皮肤细胞后对创面的修复起到了积极的作用。Nakamura【7】等将带有PDGF-BB的质粒直接注射至大鼠肌腱断端，发现具有促进局部血管化及胶原组织沉积的作用。证明了这种基因治疗的可行性。我们在前期的实验中已经证明，当PDGF-BB浓度在0-100ng/ml时，其浓度与促增殖作用呈正相关，并通过基因转染技术制备了可稳定表达PDGF-BB基因的肌腱细胞【8、9】。当将这种细胞注射到肌腱损伤部位，并在局部获得稳定持久表达的PDGF-BB，就可以达到促进肌腱愈合同时减少肌腱粘连的目的。本实验证明在早期给患处提供长期稳定的较高浓度的PDGF-BB（10ng/ml）环境，可以促进肌腱细胞增殖，达到早期内源性愈合的目的。而在正常组织受损后中，只产生较低浓度的PDGF-BB，其主要作用是对中性粒细胞、单核巨噬细胞和成纤维细胞的趋化作用10。从而造成肌腱断端处较多的成纤维细胞聚集，一定程度上反而促进了肌腱的外源性愈合，加重了粘连。本实验转染细胞在4周后逐渐失去PDGF-BB表达特性，组织浓度与对照组无明显差异，但此时组织已基本痊愈，术后8周时肌腱强度与对照组无明显差异，但粘连程度明显减轻。总之,在肌腱断端靶向使用较高浓度的PDGF-BB能达到促进肌腱内源性愈合,防止肌腱粘连的作用。而通过基因转染的办法解决PDGF-BB给药的稳定性及有效性是一种行之有效的方法及发展方向。但是本实验中仍然存在一些问题，如异体细胞注射时引起局部炎症反应，可能会加重肌腱粘连；同时如何精确控制注射的转染细胞量以得到合适的PDGF-BB表达的量等。我们进一步的研究将采取适当的手段将PDGF-BB的表达更为稳定，同时消除细胞注射引起的负面影响，在增强肌腱愈合的同时，减少肌腱粘连的发生，从而提高肌腱修复效果。参考文献1. 汤锦波,侍德,石井清一.各种伤情下屈肌腱的愈合及粘连形成:肌腱愈合新理论系统的探讨.手外科杂志,1992,8(1):3135.2. Khan U, Occleston NL, Khaw PT,et al. Differences in proliferative rate and collagen lattice concentration between endotenden and synovial fibroblasts. Hand Surg Am,1998,5:266-273. 3. C.H.Heldin，B.Wstermark et al. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor. Physiol Rev, 1999,(79):1283-1316.4. Jacques Menetrey, Channarong Kasemkijwattana, Charles S. Day, et al. Direct-,Fibroblast- and Myoblast-Mediated Gene Transfer to the Anterior Cruciate Ligament. Tissue Eng, 1999, 5(5):435-442. 5. Yoshikawa Y,Abrahamsson SO, et al. Dose-related cellular effect of platelet-derived growth factor-BB differ in various types of rabbit