口服液药品中控制菌大肠埃希菌的检查.doc

口服液药品中控制菌大肠埃希菌的检查生物工程学院 11生物5.2 作者：王千牵 绪论：大肠菌群系指一群在37、24h能发酵乳糖产酸、产气，需氧和兼性厌氧菌的革兰氏阴性无芽胞杆菌。大肠菌群主要来自人或温血动物粪便，药品中检测出大肠菌群则说明药品受到了人或动物粪便的污染，大肠菌群数量越多则表明粪便污染越严重，由此推测该药品在肠道致病菌污染的可能性，潜伏者药品中毒和流行病的威胁。故以此作为大肠菌群污染指标来评测药品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。微生物营养需求是微生物维持其生命和增长所需求的营养物质。营养物对微生物作用有：提供合成细胞质需要的物质（CO2、HCO3-、有机化合物及微量元素和生长素）；作为细胞增长和生物合成反应的能源（有机化合物、无机化合物、能源）；充当产能反应所释放的电子受体（O2、有机化合物、无机化合物中的化合氧）。按所需碳源形式的不同，微生物可分为为：自养型(即用CO2、或HCO3-作为唯一的碳源)和异养型（即需要摄取存在于相对复杂的还原态有机化合物中的碳）。按所需能源不同，微生物可分为：光营养型和化能营养型（即利用氧化-还原反应提供能源）。微生物代谢是指微生物吸收营养物质维持生命和增殖并降解基质的一系列化学反应过程，包括有机物的降解和微生物的增殖。在分解代谢中，有机物在微生物作用下，发生氧化、放热和酶降解过程，使结构复杂的大分子降解；合成代谢中，微生物利用营养物及分解代谢中释放的能量，发生还原吸热及酶的合成过程，使微生物生长增殖。内源呼吸是细胞质进行自身氧化并放出能量的过程，当有机物充足时，细胞质得到大量合成，而内源呼吸则并不显著；当缺乏营养时，则只能通过内源呼吸吸收氧化自身的细胞物质而获得微生物生命活动所需的能量。药品中检验微生物的原则：对试剂的要求：有效性和无毒性。检验方法的选择：尽量选择操作简便，快捷及避免损伤供试品中污染的微生物的方法。对照培养基的说明：由中检测所研制计分发。无法消除供试品的抑菌作用时，可根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则选择更高稀释级实验。控制菌的进一步确认应选择已被确认可的菌种鉴定方法。药品的生产、贮藏、销售及新药标准制定、进口药品标准复核、考察药品质量、仲裁中，除品种或制剂通则项下另有规定外，其微生物限度均以药典的“药品微生物限度标准”为依据。实验研究报告实验用品：光学显微镜 高压蒸汽灭菌锅 口服液1、2 试管12 小导管6 培养皿8套 接种环 酒精灯 洗耳球 1ML吸量管 脱脂棉 镊子 报纸 线绳 消毒棉球 载玻片 95乙醇 蛋白胨 乳糖 牛胆盐 琼脂 美蓝 伊红 磷酸二氢钾 葡萄糖 K2HPO4 番红 龙胆紫 乙二酸 碘片 碘化钾 甲基红 蒸馏水实验设计：6.24 上午 任务指导、列出实验用品清单、准备用品、组内分工 下午 配置乳糖发酵培养基、冷冻6.25 上午 培养基灭菌、接种、培养（ENB）实验6.26 上午 配制染液 下午 大肠埃希氏菌革兰染色、镜检6.27 上午 配置培养基 下午 分离物纯培养6.28 上午 甲基红实验分工后本人具体任务：所有无菌操作、接种培养、EMB实验、结晶紫A染液配 、生化试验试验过程： 6.24 准备实验用品 6.25 配制乳糖胆盐培养基（由一组配好各组进行分装） 包扎1ml吸量管、试管2、三角瓶2 115 灭菌15min 在超净工作台中将供试品1号、2号口服液用钳子钳开，用吸量管吸取0.1ml加入两支试管（1:10稀释），混匀，分别接种在100ml乳糖胆盐培养基1、2中，37恒温箱中培养18至24小时，进行增菌培养。6.26观察培养基中物质、配制伊红美蓝培养基（由2组配好各组自行分装），随后 包扎8套培养皿，伊红美蓝培养基，115灭菌20min。 灭菌过程中，由我3组成员配制结晶紫染液。 A：10g龙胆紫+100ml95乙醇 B：4g乙二酸+400ml蒸馏水 混合摇匀即可。 在超净工作台中将伊红美蓝培养基分装为6个平板，待冷却后 用接种环挑取培养物质在伊红美蓝琼脂平板上划线3次进行分离，1、2号培养物各接种3个平板。置37培养箱培养18至24小时进行分离培养。6.27 观察分离物质，将疑似大肠杆菌的培养物质涂片进行革兰染 色，镜检。配制乳糖发酵培养基和葡磷酸盐葡萄糖胨培养基，分装每种培养基分装至6个试管，其中在磷酸盐葡萄糖胨培养基中放入小导管。115灭菌20min。 将上述春培养物质接种在乳糖发酵管中，37下培养24至48小时。再将上述纯培养同一菌落接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，37下培养482小时。6.28观察培养基，判断结果。数据分析：6.26 观察培养基中物质，发现无太大变化，没有明显菌落，摇瓶壁周边有紫色物质，判断是口服液中细菌。6.27 观察划线分离后细菌，发现3个2号平板内均有亮紫色细小菌落，侧面观察微微发绿，表面光滑，无隆起。而3个一号平板内未发现菌群。经革兰染色发现全部是革兰氏阳性菌，未发现阴性菌，但实验还要按计划进行。6.28 观察12支液体培养基，发现磷酸盐葡萄糖胨培养基内除5号外小导管内都有微小气泡产生，培养基呈暗黄色。说明培养基内有酸性物质。乳糖发酵培养基加入甲基红指示剂后，除5号外均显红色。讨论：伊红美蓝培养基中所有药品分开加入的原因是磷酸盐与糖在水溶液中121会产生糖沙，发生聚合化学反应，生成棕黑色物质，但由于试验条件和时间原因，只能一起灭菌。5号乳糖发酵培养基加入甲基红指示剂没有变红，5磷酸盐葡萄糖胨水培养基小导管内没有产气，判断是此处染菌的结果。革兰氏染色过程中，组员擅自在空气中打开皿盖。配制结晶紫A染液时，10g龙胆紫不完全溶于95乙醇，当加入乙二酸水溶液时，龙胆紫慢慢溶解，以此推断溶解龙胆紫需乙二酸。6.27日观察划线分离物质，3个2号平板均有亮紫色细小紫色菌体