氨基酸薄层层析.doc

氨基酸薄层层析一、实验目的1、理解并掌握薄层层析法的原理。2、掌握氨基酸薄层层析法的正确的操作步骤。3、掌握根据不同物质的移动速率（Rf值）来鉴定被分离的混合物的各种组分。二、实验原理1.薄层层析原理 薄层层析时一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）2.氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。3.基于相对迁移率Rf值判定混合氨基酸组分薄层层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值 即：Rf =因为物质在一定溶剂中的分配系数是一定值，故其移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。3、 材料与方法A材料：1样品：（1）0.01mol/L丙氨酸：称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10mol。（2）0.01mol/L精氨酸：称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10mol。（3）0.01mol/L甘氨酸：称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10mol。（4） 混合氨基酸溶液：将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液2试剂：（1） 硅胶G(C.P)。（2） 0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）：取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，静置冷却，弃沉淀，取上清备用。（3） 展开溶剂：按80:10:10比例（V/V/V)混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制（4） 0.1%茚三酮溶液：取茚三酮（A.R.)0.1g溶于无水丙酮（A.R.)至100ml。（5） 展层-显色剂：按照10:1比例（V/V)混匀展开剂和0.1%茚三酮溶液。3仪器及器材：层析板（6cmx15cm）；小烧杯；量筒（10ml）；小尺子；毛细玻璃管；层析缸；烘箱B实验步骤结果处理于分析 显色 层析点样制版薄层层析的具体操作步骤： 步骤操作（1）制板调浆：称取硅胶3g，加0.5%的羧甲基纤维素钠8ml，调成均匀的糊状涂布：取洁净的干燥玻璃板，均匀涂层干燥：将玻璃板水平放置，室温下放置0.5h，自然晾干活化：70度下烘干60min（2）点样标记：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点并做好标记。每个样品间距1cm点样：用毛细管分别吸取丙氨酸、甘氨酸、精氨酸及混合氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。加样原点扩散直径不超过2mm。点样后令其自然风干。（点样次数不超过两次，以一次点样为宜）（3）层析将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂页面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层及前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，迅速用铅笔描出溶剂前沿界限（4）显色用热风吹干或在90度下烘干30min，即可显出各层斑点4、 结果与讨论结果：A层析结果 注：层析结果图从左到右依次顺序为丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、混合氨基酸B实验数据：表1各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离及溶剂前缘至样品原点中心距离记录 测定次数 各氨基酸色斑中心至原点中心的距离 丙氨酸 甘氨酸 精氨酸 混合点1 混合点2 混合点3 1 3.12 2.55 1.50 3.05 2.45 1.51 2 3.11 2.54 1.50 3.04 2.46 1.51 3 3.12 2.55 1.51 3.05 2.45 1.50 平均a值 3.11 2.54 1.50 3.04 2.45 1.50溶剂前缘至样品 3.15 3.65 4.65 3.10 3.69 4.64原点中心距离 6.26 6.19 6.15 6.14 6.14 6.14单位（cm）根据表1计算各色斑中心对应物质的Rf值如下表所示 各斑点 Rf值 氨基酸名称丙氨酸 0.49甘氨酸 0.41精氨酸 0.24 混合点1 0.50 丙氨酸 混合点2 0.40 甘氨酸混合点3 0.24 精氨酸 单位（cm）讨论1，对于实验所得的层析结果，发现存在层析板左缘（滴加丙氨酸的一缘）的溶剂前缘较层析板右缘（滴加的混合氨基酸溶液一缘）的溶剂前缘距原点中心远（两者相差0.12cm）。分析其原因可能为： 层析板的制作存在误差，导致层析板左右缘在厚度和均匀程度上存在差异，进而导致在板的两缘层析液的移动速率存在差异； 放置层析板时未垂直放置导致层析板偏向右缘，层析液扩散的起点不同导致层析结果的左右缘的溶剂前缘距原点中心的距离不同。2，除上述实验中层析板的制作误差及层析板放置误差外，还可能存在的其他误差有： 测定色斑中心至原点中心的距离时存在测量误差； 点样时未确保各加样点在同一水平线上。 上述两点误差都可导致实验结果中由混合氨基酸溶液分离开的斑点计算所得的Rf值与其相对应的标准氨基酸Rf值不同。5、 思考题 （1）硅胶的吸附力与含水量的问题答：硅胶为极性吸附剂。根据活性级别与吸附能力呈负相关的关系。而当硅胶的含水量高时，其活性级别高，则其吸附能力低；而当硅胶的含水量低时，其活性级别低，则其吸附能力高 （2）吸附实验中吸附剂的选择根据 答：对于吸附剂的选择，需根据具体的实验来确定。一般情况下，对于极性大的被测物质，应选吸附性较弱的吸附剂；对于具有亲脂性的物质则应选吸附性强的吸附剂。