外周血白细胞RNA提取并RT-PCR实验技术.doc

外周血（静脉血）白细胞RNA提取1ml外周血中加入3ml红细胞裂解液颠倒混匀，室温放置5min3000rpm离心5min弃上清。留下白细胞沉淀（或者1：1的比例裂解，重复三次）加入1ml Trizol裂解白细胞用枪将其移至EP管中反复吹打至完全分散用5ml注射器反复吹打（不少于10次）再用1ml注射器反复吹打加入1/5总体积的氯仿（200ul），颠倒混匀，室温放置5min4离心：12000rpm 15min转上层水相450ul于另一个EP管中，加入等体积的异丙醇（一师兄建议加异丙醇后-80过夜沉淀RNA，-20也可。RNA产出浓度为200-300ng/l,100l稀释），混匀，静置15min4离心：12000rpm 10min弃上清，加入预冷的75%乙醇（800-1000ml）4离心：7500rpm 5min弃上清，将EP管倒置于吸收纸上，室温放置风干将RNA重新溶于30ul（或者20ul）水中70冰箱保存，备用1、取5ulRNA进行琼脂糖凝胶电泳（使用DEPC水配置）2、取12ul总RNA进行浓度以及纯度测定 RT-PCR实验A、RNA逆转录成cDNA（PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）：1、在灭菌0.1%DEPC浸泡过夜的1.5ml离心管中配制下列混合液 Oligo dT Primer （50uM） 1ul dNTP mixture (10mM each) 1ulRNA模板0.5ug5ug（根据说明书要求以及RNA浓度计算得到）RNase Free dH2O 适量至总体积为10ul2、65保温5min后，冰上迅速冷却1min以上3、在上述离心管中继续配制下列反应液，总量为20ul 上述变性后反应液 10ul 5X PrimeScriptII Buffer 4ul RNase Inhibitor (40U/ul) 0.5ul PrimeScriptII RTase (200U/ul) 1ul RNase Free dH2O 至20ul4、缓慢混匀，轻轻用枪吹打或手指轻弹，稍离心5、42， 3060min6、70， 灭活15min后，冰上迅速冷却B、PCR实验 （25ul反应体系）： Taqmix 12.5ul 引物1（上游）（1020nM） 0.5ul 引物2（下游）（1020nM） 0.5ul cDNA 2ul（可调整）超纯水 加至总体积25ulPCR步骤：1、Hold on 94 5min2、Cycle 94 40s3、退火温度： X 40s4、72 40s repeat “24步骤”5、72 10min6、4 60min琼脂糖凝胶电泳1、1.5g（根据PCR产物片段大小）琼脂糖溶于100ml 1X TBE中，微波炉3min后冷却至6070左右加入5ul EB溶液。2、待凝胶凝固后移至电泳槽中，负极为上样孔位置，约10ul/孔3、电压100V 50min（根据分子大小）4、紫外透射仪上初步观察条带，并使用凝胶成像分析仪拍照储存氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA的亲水基团，与水相接触。所以不要剧烈震荡。异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提完之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作，不过个人经验感觉加不加没什么太大区别，也许是我的样品里蛋白不多吧异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量少