EMSA 中文操作说明.docx

Procedure for Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) This kit has been optimized for use with polyacrylamide mini (8 8 0.1cm) gels. For larger gels, adjust electrophoresis conditions and detection reagent volumes accordingly. A. Plan Binding Reactions Understanding the Control EBNA System Include a complete set of three reactions each time an EMSA is performed. These reactions and expected results for the Control Epstein-Barr nuclear antigen (EBNA) System, which is included with the kit, are described in Table 1.Table 1. Description of control reactions and expected results.ReactionContents of ReactionDescriptionResult#1Biotin-EBNA Control DNANo protein extract for DNA to bind; therefore, no shift is observed. Establishes the position of an unshifted probe band.#2Biotin-EBNA Control DNA + EBNA extractContains sufficient target protein to effect binding and shift of the Biotin-EBNA DNA. Shift detected by comparison to band position in #1#3Biotin-EBNA Control DNA + EBNA extract + 200-fold molar excess of unlabeled EBNA DNADemonstrates that the signal shift observed in #2 can be prevented by competition from excess non-labeled DNA, i.e., the shift results from specific protein:DNA interaction.The Control EBNA System results reported in Table 1 were generated using binding reactions prepared according to Table 2. Each 20 l binding reaction contains 20 fmol of Biotin-EBNA Control DNA. Reactions were electrophoresed, transferred and detected according to the steps in Sections B-G of this protocol. If the kit is being used for the first time, perform the Control EBNA System reactions to verify that the kit components and overall procedure are working properly.Table 2. Binding reactions for Control EBNA System.ComponentFinal AmountControl Reactions#1#2#3Ultrapure Water-12L11L9L10X Binding Buffer (20148A)1X2L2L2L50% Glycerol (20148F)2.5%1L1L1L100mM MgCl2 (20148I)5mM1L1L1L1 g/L Poly (dIdC) (20148E)50 ng/L1L1L1L1% NP-40 (20148G)0.05%1L1L1LUnlabeled EBNA DNA (20148C)4 pmol-2LEBNA Extract (20148D)1 Unit-1L1LBiotinEBNA Control DNA (20148B)20 fmol2L2L2LTotal Volume-20L20L20LTable 3. Binding reactions for the Test System.ComponentFinal AmountReaction#1#2#3Ultrapure Water10X Binding Buffer (20148A)1X2L2L2L1g/L Poly (dIdC) (20148E)50 ng/L1L1L1LOptional: 50% Glycerol (20148F)Optional: 1% NP-40 (20148G)Optional: 1M KCl (20148H)Optional: 100mM MgCl2 (20148I)Optional: 200mM EDTA (20148J)Unlabeled Target DNA4 pmol-Protein Extract (e.g., 2-3 l NE-PER Reagent extract)system-dependent-Biotin End-Labeled Target DNATotal Volume-20L20L20LB准备与预电泳1. 用0.5XTBE准备非变性的聚丙烯酰胺凝胶或预制的DNA阻滞凝胶。适当的凝胶浓度依赖于DNA和连接蛋白的大小。大部分系统用46%的聚丙烯凝胶。2. 将胶放于电泳设备并将其固定。注入0.5XTBE，距顶部数毫米。电泳槽外边注入0.5XTBE，高于容器的底部，通过此来降低电泳时的温度。冲洗容器并对胶进行3060分钟的预电泳。 8 8 0.1cm的胶需要100V电压。3. 胶进行预电泳并进行C部分。C准备并完成结合反应 注：注意A部分的内容以确定系统工作的正常。1. 在冰中融化结合反应各试剂，EBNA控制系统的各试剂和实验样本。避免DNA探针的过度加温。EBNA提取物直到用时在融化。2. 按照A部分的表2和3为EBNA控制系统and/or实验系统准备完整的20 l反应体系。3. 在室温孵育结合反应液20分钟。4. 每个20 l反应体系中添加5 l的5X Loading Buffer，并吹打数分钟以充分混匀。不能涡旋或剧烈混合。D电泳移动结合反应1. 却断凝胶电泳的电源；2. 冲洗，每样本加入20 l到凝胶上；3. 开启电流(set to 100 V for 8 8 0.1cm gel)，电泳样本直到溴酚蓝跑过凝胶总长度的2/3到 3/4时。在6%的聚丙烯凝胶中，自由状态的生物素标记的EBNA控制DNA跑出的条带仅次于溴酚蓝。E电泳的结合反应转移到尼龙膜1. 在0.5X TBE中浸泡尼龙膜至少10分钟；2. 依照说明将胶合尼龙膜放于（夹住）清洁的电泳转移装置中。在恒温槽中用0.5X TBE将温度冷却到10。用超净镊子和无粉手套来处理在四角中的尼龙膜。注.使用清洁的转移海绵。避免使用Western blots用过的海绵。3. 在380 mA (100V)中转移30分钟。对小胶块（8 8 0.1cm）用标准的转移槽设备的典型转移时间为3060分钟（380 mA）4. 转移完成后，将溴酚蓝部分的膜放于干的纸巾上。（不要在胶上保留染料。）膜表面可有缓冲液，以被膜吸收。这将消耗一分钟时间。始终保持膜的湿润。并接着做F部分。F.转移DNA膜的交联共有三个交联方案可供选择i. 在120 mJ/cm2 的条件下用商品化紫外线交联仪器设备的254nm的紫外灯下进行交联（用自动交联功能曝光45-60秒）ii. 用手提式紫外灯设备用254nm灯泡在距膜0.5cm处曝光5-10分钟进行交联。iii. 用透照器设备在312nm下曝光10-15分钟进行交联。注：对膜进行交联后直接进行G部分的操作。另外，膜在室温干燥环境下可贮存若干天。在进行G部分之前不要再将膜弄湿。G用化学发光法检测生物素标记的DNA 下边是以8 10cm大的膜而推荐的体积。如果是用的较大的膜要对G部分所用的体积做适当的调整。完成所有的阻断后，将干净托盘或塑料的物件放在定轨振荡器上检测孵育。1. 用水浴温和的将Blocking Buffer and the 4X Wash Buffer 加热到37-50C直到所有颗粒完全溶解。缓冲液的应用环境应该在室和50C之间，只要所有颗粒都保持溶解状态。底物平衡缓冲液在4C到室温之间应用。2. 添加20mL封闭缓冲液来对膜进行封闭，并轻柔摇动的情况下孵育15分钟。3. 准备结合/阻断缓冲溶液，将66.7L链霉亲和辣根过氧化物酶共轭体稀释到20mL(1：300倍稀释)注：结合/阻断缓冲溶液作为优化核酸检测的方案不容修改。4. 从膜上倒出阻滞缓冲液，并在将其放到结合/阻断缓冲溶液中。中再次将膜在缓冲液中孵育15分钟并轻微晃动。5. 准备，（将40mL 4X洗液加入到120mL超纯水中）。6. 将膜转移到一个新的容器中，用20mL 1X洗液简单冲洗。7. 用1X洗液在摇晃下对膜冲洗4次，每次5分钟。8. 将膜转移到一个新的容器中，加入30mL底物平衡液。轻微晃动下孵育5分钟。9. 准备底物工作液，加6mL鲁米诺/增强因子到6mL稳定双氧水。注：暴露于阳光或强光下会损伤工作液。将工作液保存在棕色瓶中，避免长时间暴露在强光下。在实验室常用灯光下曝光较短的时间不会影响工作液的活性。10. 在底物平衡液中将膜取出，在膜的一侧用吸水纸轻轻的吸掉多余液体。将膜放在干净容器中或是干净的塑料包表面需保持处于平面。11. 将底物工作液倾注到膜表面，并确保其覆盖到膜的整个表面。另外也可以将膜的DNA面朝下放到工作液中。在底物溶液中将膜孵育5分钟，勿摇动。12. 将膜从工作液中取出，用滤纸从一侧将多余的液体吸干，大约2-5分钟。不要让膜变得干燥。13. 将潮湿的膜用塑料封皮包起来，避免气泡和褶皱的产生。14. 用适宜的CCD相机曝光，或将膜放到暗盒中在X线胶片上曝光2-5分钟。用商品化设备将胶片显像。为了得到想要的信号，曝光时间可以调整。故障排除问题原因解决方案高背景封闭液或洗液中的颗粒温和的加温直到没有颗粒存在TBE中有杂质应用高品质试剂或在使用前用0.2m滤器过滤转移部分或所用的海面被污染用干净设备并确定海绵不是在Western blotting用过斑点HRP共轭体中有沉淀用0.2m滤器过滤或用离心机最大转速离心1分钟气泡在转移前将胶与膜之间的气泡排出无条带或低信号所用DNA没有生物素标记用前将DNA生物素标记标记的DNA不充足增加标记后DNA的浓度DNA片段被降解检测DNA片段的完整性转移到膜的量太少检查转移记录膜的类型应用错误B