DNA琼脂糖凝胶电泳.doc

分子醫學技能DNA瓊脂糖凝膠電泳一、實驗目的和應用價值1.分析PCR產物2.分析基因多態性3.掌握DNA電泳技術二、實驗原理在pH8.0(鹼性)的環境中，DNA的磷酸基因解離，使DNA在該環境中帶上負電荷，在電場中向正極方向泳動，因為各種DNA分子的電荷數、構象、分子量不同，他們在通過凝膠立體網絡時所受的動力和阻力不同，所以泳動的速度有差異，達到分離的目的。三、實驗基本流程和注意事項瓊脂糖凝膠板的製備(封板、梳子位置與高度、凝固後拔梳) 倒緩衝液，加樣(樣品中加入1/5體積的上樣buffer) 電泳(方向、電壓、時間) 染色與檢測(EB 10分鐘，紫外檢測)四、實驗結果與討論瓊脂糖凝膠的特點瓊脂糖凝膠是依靠糖分子上的羥基由於氫鍵的作用相互連接，形成三微空間結構，結構的疏密由瓊脂糖的濃度決定。瓊脂糖凝膠在3640下開始凝固，約一小時候就會出現裂痕，若要妥善保存，應用保鮮膜覆蓋，保存於4冰箱。瓊脂糖中常見的雜質是硫酸鹽、丙酮酸鹽等，這些雜質除了會影響凝膠的融化與凝結溫度外，還會產生電滲作用(electroosmosis)，降低電泳的解析度。如何提高核酸電泳的解析度？1.提高瓊脂糖的濃度減小凝膠孔徑來提高電泳解析度2.改用聚丙烯醯胺凝膠3.降低跑電泳的電壓，增大跑電泳的時間影響DNA在凝膠中遷移速率的因素1.DNA分子的相對分子質量：雙鏈線狀DNA分子遷移的速率與其鹼基對數值近似成反比。樣品分子越大，在通過膠孔時的摩擦阻滯力越大，泳動速度越慢。2.構象：共價閉環DNA分子直線DNA分子開環雙鏈DNA分子3.凝膠濃度：濃度越低，相同核酸分子遷移越快。凝膠濃度愈低，則凝膠孔徑愈大(但凝膠的強度也愈低)。一般地分子量越大，選用的凝膠濃度應越小。4.電壓:低電壓時DNA片段遷移率與所用電壓成正比。但隨著電壓上升，不同長度DNA泳動的增加程度不同，解析度會降低5.離子強度：緩衝液中無離子時，DNA幾乎不移動。而在高離子強度下，導電性極高，帶電顆粒泳動很快，並產生大量的熱，有時甚至熔化凝膠或使DNA變性溴化乙錠是一種核酸染料，常在瓊脂糖凝膠電泳中用於核酸染色。在標準302nm紫外光的照射下，未與核酸結合的溴化乙錠可被激發出橙紅色螢光，在與DNA或雙股RNA結合時，螢光強度會增強20倍，使得核酸電泳後的膠片可以辨識核酸的相對位置。溴化乙錠含有一個可以嵌入DNA堆積鹼基之間的一個三環平面基團。它與DNA的結合幾乎沒有鹼基序列特異性。在高離子強度的飽和溶液中，大約每2.5個鹼基插入一個溴化乙錠分子。當染料分子插入後，其平面基團與螺旋的軸線垂直並通過範德華力與上下鹼基相互作用。這個基團的固定位置及其與鹼基的密切接近，導致與DNA結合的染料呈現螢光，其螢光產率比遊離溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射並傳遞給染料，而被結合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區的590nm處重新發射出來。由於溴化乙錠-DNA複合物的螢光產率比沒有結合DNA的染料高出20-30倍，所以當凝膠中含有遊離的溴化乙錠（0.5ug/ml）時，可以檢測到少至10ng的DNA條帶。完成基因克隆技術最重要的要素將外源基因通過體外重組後導入受體細胞，使該基因能在受體細胞內複製、轉錄、翻譯和表達，整個操作稱為基因重組技術。要實施該技術必須具備四大要素：工具酶、載體、基因和受體（宿主）細胞。1.工具酶：基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA 線形分子片段準確地切出來，需要各種限制性核酸內切酶；要把不同片段連接起來，需要DNA 連接酶；要合成基因或其中的一個片段，需要DNA 聚合酶等。因此，酶是DNA 重組技術中必不可少的工具，基因工程中所用的酶統稱為工具酶。工具酶就其用途而言可分為三大類：限制性內切酶、連接酶和修飾酶。基因重組正是利用了這些工具酶對DNA 分子進行一系列的酶催化反應，才得以在體外實現DNA 分子的切割和連接。2.載體（Vectors）：一種能夠結合外源DNA 片段形成重組DNA，並能進行自我複製的DNA 分子稱為載體。載體的具體種類有：質粒、噬菌體、病毒、人工染色體，分別應用於原核細胞或真核細胞。從功能來分，有克隆載體（構建基因組文庫或cDNA 文庫）、測序載體、表達載體以及能在兩個不同物種中存在的穿梭質粒。隨著生物技術的發展和科學研究的深入，不斷出現具有不同功能的新載體，如可以容納幾百萬鹼基的酵母人工染色體。3.基因：得到多拷貝目的基因或外源基因並獲得表達是克隆的根本目的，但首先要得到含有該基因的範本，因此分離原始基因是必要的。基因的來源一般可以從以下幾個途徑獲得：染色體DNA、RNA、化學合成基因。4.受體細胞：受體細胞的選擇是否合適將關係到能否表達，特別是高效表達。選擇受體細胞的一般原則：易於接納外源DNA；無特異的內源核酸內切酶；載體複製、擴增不受阻；與載體有互補性。根據不同的需求，還應考慮：表達載體所含的選擇性標記與受體細胞基因型是否匹配；遺傳穩定性高，易於進行擴大培養；受體細胞內源蛋白水解酶基因確失或蛋白酶含量低，利於外源基因蛋白表達產物在細胞內積累；可使外源基因高效分泌表達；對動物細胞而言，所選用的受體細胞對培養的適應性強；如：可以進行貼壁或懸浮培養，可以在無血清培養基中進行培養。受體細胞在遺傳密碼子的應用上無明顯偏倚性；無致病性；具有好的翻譯後加工機制等。鐮刀型細胞貧血的治療方案就現在的醫學技術，修復缺陷的基因並非不可能，但有一定的風險。基因轉移技術是基因治療的關鍵技術之一，基因轉移的途徑有兩類，一類是invivo(體內)，即活體接轉移，是將帶有遺傳物質的病毒、脂質體或裸露的DNA質接注射到試驗個體內；另一類是exvivo(離體)，稱為回體轉移，是將試驗對象的細胞取出，在體外培養並導入基因後，將這些經遺傳修飾的細胞重新輸回到試驗個體體內。exvivo方法比較經典、安全、效果容易控制，但缺點是步驟多、技術複雜、難度大，不容易推廣；invivo方法操作簡便，容易推廣，缺點是方法尚未成熟，存在療效短，免疫排斥和安全性等問題。一氧化氮或可減輕鐮刀形紅細胞貧血症患者痛感人民健康網新華網華盛頓月日電 吸入一氧化氮（）氣體，也許能減輕鐮刀形紅細胞貧血症患者的痛感。這是美國科學家最新研究成果，但仍需進一步人體臨床試驗。鐮刀形紅細胞貧血症是一種遺傳性疾病，主要由人體內合成血紅蛋白的基因突變引起。其一奇怪特徵是，血液中的紅細胞會由正常的圓形變成鐮刀狀。醫學界傳統觀念認為，變形的紅細胞會堵塞血管，使血液和氧供應量減少，造成了溶血性貧血，並導致患者關節、四肢等部位週期性地感覺劇痛。美國國家衛生研究所格拉德溫等人的最新研究發現，對這種痛感起重要作用的可能還有由變形紅細胞釋放進入血液的血紅蛋白。血紅蛋白存在于極易碎裂的紅細胞中，其功能是運送氧到血液中去。研究人員發現，當這些血紅蛋白以自由狀態進入血液迴圈後，其與一氧化氮產生反應的速度，將比在紅細胞中時快出上千倍，一氧化氮因此而被過度“清除”。格拉德溫等人日在網路版自然醫學雜誌發表論文指出，一氧化氮能夠通過鬆弛血管而調節血壓，當它被自由迴圈的血紅蛋白