蜗牛酶提取新生隐球菌基因.doc

蜗牛酶提取新生隐球菌基因组一、试剂准备1 巯基化合物(0.04M EDTA和0.14M -巯基乙醇)（30ml）：0.5M EDTA 2.4 ml 巯基乙醇（分析纯=1.11439g/ml） 294 l 无菌水 27.3 ml在通风橱中操作，将三者加入50ml离心管中，涡旋震荡混匀，用膜封口，4保存。2 蜗牛酶的溶解： 1） 1g市售蜗牛酶（用前4保存）。 2） 配置pH5.8的磷酸钾缓冲液（100ml）： 1 mol / L K2HPO4 1 mol / L KH2PO4 8.5 ml 91.5 ml3） 配置SCPB缓冲液（10ml）：1.82g山梨醇、0.042g柠檬酸钠，用10ml pH5.8磷酸钾缓冲液溶解，涡旋震荡混匀，在超净台中，滤器过滤除菌，4保存。4） 超净台中，将5ml SCPB缓冲液加入到装有1g蜗牛酶的棕色瓶中，轻轻摇动混匀，务必使蜗牛酶完全溶解，用之前用枪头挑一下瓶底，看是否有未溶解的酶，若有则继续摇动或用枪头吹吸之溶解。溶解后的蜗牛酶成为200mg / ml的溶液，4保存。3 SE缓冲液（30ml）： 1.5M NaCl 3ml；0.5M EDTA（pH8.0） 6ml；无菌水 21ml。超净台中配置。涡旋混匀，4保存。4 液（30ml）： 0.5M EDTA（pH8.0） 1.2ml 1M Tris-Cl（pH8.0） 1.5ml 无菌水 27.3ml 超净台中配置。涡旋混匀，4保存。5 10% SDS（30ml）：30ml无菌水溶解3g SDS，涡旋溶解，无需灭菌，常温静置。6 5M KAc（30ml）：30ml双蒸水溶解14.73g乙酸钾，高压灭菌， 4保存，使用前20min置于-20冰箱预冷。7 氯仿-异戊醇（24:1）（12.5ml）：12ml氯仿与0.5ml异戊醇混合均匀，用膜封口，4保存。8 异丙醇（-20）；70%乙醇（-20）；无菌水（4）二、实验步骤接菌环挑取一环菌体，接种于液体SDA培养基中，37，200转摇培48-72h，准备菌液。实验前准备32、65水浴和冰盒。1、3-5ml菌液分次加入1.5ml离心管中，室温10000rpm离心1min，弃上清。2、200l无菌水洗涤菌体（吹吸重悬），室温10000rpm离心1min，弃上清。3、重复步骤2一两次4、用巯基化合物预处理菌体，以提高蜗牛酶作用效果：菌体悬于300-500l巯基化合物中，32水浴15-30min。期间轻轻颠倒离心管两三次。5、室温10000rpm离心1min，弃上清。6、用500l SCPB缓冲液悬浮菌体，加入100l蜗牛酶溶液，32水浴40min，期间轻轻颠倒离心管五六次。7、室温13000rpm离心2min，弃上清。8、500l SE液洗涤沉淀，将其吹打悬浮，室温10000rpm离心1min，弃上清。9、重复步骤8五六次。10、加500l液和50l 10% SDS，吹打混匀，65水浴30min，期间轻轻颠倒离心管两三次。11、加200l 5M KAc溶液，冰浴30min。12、4，12000rpm离心15min。将上清转移新离心管中，计量上清体积。13、加等体积氯仿-异戊醇，剧烈震荡，4，6000rpm离心10min，将上清转移至新离心管中。14、重复步骤13一次，计量上清体积。加等体积冷异丙醇，-20度静置10min15、4，13000rpm