不同采血管对核酸检测结果的影响.doc

不同采血管对核酸检测结果的影响采用核酸检测( NAT) 技术对献血者血液标本进行筛查，采血管是提高血液安全性的重要举措。NAT 技术的灵敏度极高，其缩短检测窗口期的能力远远高于血清学方法，但是如果标本的采集、处理、保存不当，会造成病毒核酸降解，从而影响检测结果的真实性，降低核酸检测本身的灵敏度，对血液安全带来潜在风险。对此，试剂和采血管的厂方说明书都提出了各自对于标本处理的指导意见。但是不同实验室标本采集过程，运输、保存条件不尽相同，对标本质量的影响也存在差异。为确保血液标本满足 NAT 检测要求，我们采用不同的试验方案，验证不同品牌无菌无 RNAase 真空采血管、保存温度、离心前保存时间等对 NAT 检测结果的影响。为选择符合 NAT 要求的采血管、优化标本控制过程、制定核酸检测策略等提供数据支持。 1 材料与方法 1. 1 材料 1) 采血管: 从市售采血管中选择 3 种 EDTA K2抗凝的，有分离胶，一次性无菌无 RNAase 真空采血管，根据生产厂家不同，称为 A、B、C 采血管。2) 检测标本: 试验用阴性标本: 对献血者全血标本进行血清学检测和 NAT 检测，将检测结果呈 HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、HBV DNA、HCV RNA、HIV-1 RNA 阴性的标本进行汇集，作为试验用阴性标本。试验用 HBV 阳性血浆: 从 HBsAg、HBV DNA 检测结果呈阳性，其余项目检测结果呈阴性的献血者全血标本中分离的血浆，经 HBV DNA 定量检测，HBV 浓度为 1. 24 104IU / ml。试验用 HCV 阳性血浆: 从抗-HCV、HCV RNA 检测结果呈阳性，其余项目检测结果呈阴性的献血者全血标本中分离的血浆，经HCV RNA 定量检测，HCV 浓度为 6. 88 103IU / ml。试验用HIV-1 阳性血浆: 从抗-HIV、HIV-1 RNA 检测结果呈阳性，其余项目检测结果呈阴性的献血者全血标本中分离的血浆，经HIV-1 RNA 定量检测，HIV-1 浓度为 1. 08 105IU / ml。3) 试剂: NAT 联检和鉴别检测分别采用 ，NAT 定量检测采用 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test 试剂( 批号: N11304， ，血清学检测所用试剂均为血液中心常规检测试剂。4) 检测设备: NAT 联检和鉴别检测采用 ProcleixTigris 系统，NAT 定量检测采用 Roche CAP / CTM 系统。 1. 2 标本保存温度、离心前保存时间及采血管对 NAT 联检试验结果的影响 将血清学和 NAT 检测结果均呈阴性的全血标本，以每 6 份标本混为 1 份的原则进行混匀; 向混匀后的标本中加入已知浓度的 HBV 或 HCV 或 HIV-1 阳性血浆，使 HBV 或 HCV 或 HIV-1 的终浓度分别为 50 IU/ml、60 IU/ml 和 150 IU / ml; 混匀后的全血标本分别分装至采血管 A、B、C 中，形成 3 组试验标本，分别标记为 A 组、B 组和 C 组。然后每组标本再分为 2 个亚组，分别置于 4和 30保存; 于 0h( 阳性对照) 、4、6、8、10、12、24 h 分别取一定数量的标本，在1 000 g 条件下离心 10 min，之后在原温度下继续保存; 在 25h 进行 NAT 联检检测，统计分析检测结果。 1. 3 标本保存时间、采血管对 NAT 鉴别试验结果的影响按照 1. 2 所示方法将制备好 HBV( 50 IU/ml) 、HCV( 60 IU/ml) 或 HIV-1 ( 150 IU / ml) 的弱阳性全血标本混匀后分装至A、B、C 3 种真空采血管中，形成 3 组试验标本。再将不同组、不同病毒种类的标本分为 7 个小组，全部标本在 1 000 g条件下离心 10 min 后在 4保存。依次于 0 d( 阳性对照) 、1、2、3、4、5、6、7 d 的同一时间取 1 组标本进行 NAT 鉴别检测。分析统计不同保存时间对 HBV 或 HCV 或 HIV-1 弱阳性标本 NAT 鉴别试验结果的影响。 1. 4 保存时间对 HCV 阳性标本 NAT 定量结果的影响 选取 9 份检测结果呈抗-HCV、HCV RNA 阳性，HBsAg、抗-HIV、HBV DNA、HIV-1 RNA 阴性的献血者全血标本，使用血清学及 NAT 检测结果均呈阴性的血浆分别进行稀释，使其成为HCV 含量在 1. 04 102IU / ml 4. 86 103IU / ml 之间的弱阳性标本。再将每个弱阳性标本等量分成 8 份放置于真空采血管 A 中。全部标本在 1 000 g 条件下离心 10 min 后，4保存。依次于 0、1、2、3、4、5、6、7 d 的同一时间取 1 组标本进行定量 HCV RNA 检测。分析研究 4保存条件下保存时间对血浆中 HCV RNA 浓度的影响。 1. 5 统计学方法 标本保存温度、标本离心前保存时间及采血管对 NAT 联检试验结果影响的研究、及标本保存时间对 NAT 鉴别试验结果影响的研究均采用卡方检验进行实验结果的统计分析; 保存时间对 HCV 阳性标本定量结果影响的研究采用 SPSS 17. 0 软件进行重复测量数据的方差分析。P 0. 05 和 0. 01，认为差异有统计学意义。 2 结果 2. 1 标本保存温度、离心前保存时间及采血管对 NAT 联检试验结果的影响 表 1 显示了 A、B、C 3 种采血管，在 4或30 、24 h 内保存全血标本时，含 HBV( 50 IU / ml) 、或 HCV( 60 IU/ml) 、或 HIV-1( 150 IU/ml) 的弱阳性标本的 NAT 检出率。结果证实，4或 30保存全血标本时，4 24 h 的离心前保存时间对弱阳性标本 NAT 检出率的影响差异无统计学意义( P 0. 05) ，同时，试验结果还表明，在 24 h 内，4或30 的保存温度对于弱阳性全血标本 NAT 检出率的影响差异无统计学意义( P 0. 05) ，均能保证标本中病毒核酸的稳定。在 4或 30、24 h 内保存弱阳性全血标本时，不同采血管的保存效果差别无统计学意义。 2. 2 标本保存时间、采血管对 NAT 鉴别试验结果的影响表 2 显示在4保存7 d 内，采用 C 采血管保存含 HIV-1( 150IU / ml) 、或 HCV( 60 IU / ml) 、或 HBV( 50 IU / ml) 弱阳性标本的检出率均为 100%。说明 C 采血管对弱阳性标本的 NAT鉴别试验检出率没有明显影响。同时采用 A 采血管保存含HCV( 60 IU / ml) ，采用 B 采血管保存含 HIV-1( 150 IU / ml) 和含 HCV( 60 IU/ml) 的弱阳性标本时，NAT 检出率没有显著变化。但是采用 A 采血管，保存含 HIV-1( 150 IU/ml) 和HBV( 50 IU / ml) 的弱阳性标本，在保存后 d 2 时都出现了标本 NAT 鉴别试验检出率差异有统计学意义( 2= 4. 36，P 0. 05; 2= 11. 68，P 0. 01 ) ，其 NAT 检出率分别从 0 d 的100% 和 97% ，下降至 91% 和 63% 。而且在保存含 HIV-1( 150 IU/ml) 的弱阳性标本 d 3 时，该标本的 NAT 检出率进一步下降至 70%，与保存后 d 2 相比，差异具有统计学意义( 2= 9. 88，P 0. 01) ，保存至 d 4 后，A 采血管中保存的含HIV-1( 150 IU / ml) 的弱阳性标本的 NAT 检出率略有上升，维持在稳定水平但 d 4、d 5、d 6、d 7 该弱阳性标本的 NAT 检出率与 0 d 相比，差异仍具有统计学意义( 2依次为 7. 62，19. 53，14. 83，9. 71，P 0. 01 ) 。而采用 B 采血管保存含HBV( 50 IU / ml) 的弱阳性标本时也曾出现 NAT 鉴别试验检出率下降的现象，分别出现在保存后的 d 3 和 d 7( NAT 检出率均为 83%) ，与保存前相比差异有统计学意义( 2= 10. 91，2= 10. 91; P 0. 01) 。 2. 3 保存时间对 HCV 阳性标本定量结果的影响 9 份HCV 弱阳性标本在 4 保存 7 d，每天在相同的时点进行定量 HCV RNA 检测，结果显示，9 份标本的浓度 7 d 内没有出现明显变化，每份标本 7 d 内的浓度变化均在 0. 56 log 之内( 表 3) ，且有相同的变化趋势( 图 1) 。使用 SPSS 软件分析 9份标本的浓度变化，整合统计后输出 HCV 弱阳性标本浓度均值变化趋势见图 2。从图 2 可以看出，在 4保存 7 d 内，HCV 弱阳性标本浓度的均值变化较小，其变化范围为 0. 24log 以内。同时，图 2 也显示在 4 保存 2 d 后，HCV 弱阳性标本的浓度开始下降，保存至 d 4、d 5 时，其浓度较 d 2 差异出现统计学意义( P 0. 01，P 0. 05) 。随后在保存的 d 6时又出现上升，与 d 5 相比较差异显著( P 0. 01) ，但仍低于保存 d 2 时的浓度。 3 讨论 本研究旨在通过探究不同标本保存条件、不同采血管对于血液标本中 HBV、HCV 和 HIV-1 的稳定性的影响，明确实验室对 NAT 标本的控制要求，为实验室检测前过程控制策略的制定提供数据支持。我们的研究显示，保存温度( 4或30 ) 和离心处理时间 ( 采集后 24 h 内) 对含 HBV( 50 IU /ml) 、HCV( 60 IU / ml) 、HIV-1 ( 150 IU / ml) 的弱阳性标本的NAT 检测结果的影响无统计学意义。Damen 等也报道含有 HCV 的血清标本 30保存时，直到 d 7 才会出现 HCV 浓度的显著下降。文献2，3报道 HIV-1 在室温条件下是比较稳定的，能够稳定保存 30 h 以上。HBV 病毒也有较好的稳定性。另外该研究中 3 种采血管的联检试验结果没有显著差异。所以在不超过 30 的采血环境中，NAT 标本的现场保存，只需和采集的血液一样保存即可，并在采集后 24h 内离心处理，如此操作不会对 HBV、HCV、HIV-1 弱阳性本 d 2 的检测质量产生影响。 我们的研究表明，在 4保存 7 d 内，采用 C 采血管保存含 HIV-1( 150 IU/ml) 、或 HCV( 60 IU/ml) 、或 HBV( 50 IU/ml) 弱阳性标本的检出率均为 100% 。同时采用 A 采血管保存含 HCV( 60 IU/ml) ，采用 B 采血管保存含 HIV-1( 150 IU/ml) 和含 HCV( 60 IU / ml) 的弱阳性标本时，NAT 检出率没有显著变化。Gessoni 等将血浆标本保存 168 h 后，定量检测HBV，发现 6 个标本中只有 1 个出现显著下降。我们的研究结果与 Gessoni 等的研究结果相同。Busch 等通过半定量的方法也发现在 4保存 7 d 时，HCV 的含量不会出现显著下降。Sener 等利用实时荧光 PCR 技术对 19 份浓度不一的 HCV 标本进行定量分析后，也发现 HCV 能在4保存5周以上。Jos 等研究发现无论浓度多少，HIV-1 都能在5 条件下至少稳定保存 14 d。但是值得关注的是采用 A 采血管时，从 4保存 d 2 起，含 HIV-1 弱阳性标本的 NAT 检出率开始下降，及至 d 3 时，出现显著下降。采用 B 采血管保存含 HBV( 50 IU/ml) 的弱阳性标本时，在 4保存的 d 3，也出现了含 HBV 弱阳性标本的 NAT 检出率下降的现象。而这一现象也在 Gessoni 等的试验中得到过印证。Gessoni 等发现 4保存血浆标本 72h 时，2 /6 的 HCV 标本以及 1 /6 的 HIV-1 标本首次出现下降。这可能是由于单核细胞释放的脂酶破坏病毒核衣壳，进而 RNAase 降解病毒造成的。另外采用 A 采血管在 4保存d 2 时，HBV 弱阳性标本的 NAT 检出率为 63% 。同时观察到该 HBV 阳性对照组的 NAT 检出率低于 100%，为 97%。分析原因可能由于该组标本浓度接近 Procleix Tigris 检测系统的检测下限，从而导致该组标本的阳性对照组不能 100% 检出，而且同时由于标本制备过程中的随机误差造成 63%这样的离群值产生。保存时间对 HCV 阳性标本定量结果的影响研究显示，试验标本在 4保存 7 d 内，9 份弱阳性 HCV 标本的含量没有出现显著的变化，保持在 1 个稳定的范围内。这与前面 2. 2 试验中弱阳性标本的 NAT 鉴别实验检出率变化情况相一致。另外所有 9 份标本浓度变化的总体趋势相一致，即在d 1 稍下降，但是不显