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促红细胞生成素的生产工艺及研究进展 展康华 200977505143（烟台大学生命科学学院，烟台 264000）摘要 主要介绍了促红细胞生成素的基本性质与生产工艺以及研究进展。关键字 促红细胞生成素 性质 生产工艺 中图分类号： TS264.4 文献标识码： A引言促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO)是由肾脏和肝脏分泌的一种激素类物质，传统认识中，EPO是一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化，最终成熟的内分泌激素。对机体供氧状况发挥重要调控作用。在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌1。人类EPO基因位于7号染色体长22区。1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重组技术开始大批量生产重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin, rHuEPO）,广泛用于临床。随着近年来研究不断进展，对于EPO的认识产生了一次革命性的飞跃。在基因重组技术诞生前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取，80年代的分子生物学技术的迅速发展，使得人们对于促红素的基因和蛋白质结构、调节机理以及受体和信号传导机理等方面有了较深入的了解。1985年Lin等首先从人类基因库中分离EPO基因，测定其核苷酸序列，并在哺乳动物细胞中获得表达。1989年美国Amgen公司在国际上首次研制成功重组人促红细胞生成素，用于治疗肾性贫血，取得了令人瞩目的疗2。2 促红细胞生成素的性质 促红细胞生成素是一种高度糖基化的糖蛋白，分子量约34kD。血浆中存在的EPO由165个氨基酸组成，糖基化程度很高，糖基成分主要是唾液酸。已证明血和尿中都有它的存在。未分化的干细胞分化成红细胞系干细胞，促红细胞生成素在此发挥作用，使之变为前成红细胞。对进一步再成熟为成红血细胞、网织红细胞，血红蛋白的合成以及流入末梢血管等均有促进作用。根据碳水化合物含量不同，天然存在的EPO分为两种类型，型含34%的碳水化合物，型含26%的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同3。3 生产工艺现阶段重组DNA技术生产的红细胞生成素，将红细胞生成素的基因连接到表达载体上，转化CHO细胞，在无血清培养基中培养，培养基上清液预处理后，经染料亲和, 离子交换, 分子筛三步层析，得到高纯度高比活性的EPO。该工艺路线简单，适于符合规定的制药企业大规模生产4。生产工艺大体如下： 控制参数 培养基获得目的基因 种子细胞 扩增 生产细胞 生物反应器 收液 分离纯化 EPO原液3.1 表达EPO的细胞株的构建3.1.1 构建促红细胞生成素的表达载体有两种方式获得编码人促红细胞生成素基因。一种是提取胎肝染色体DNA，然后以特异性寡核苷酸为引物，经聚合酶链式反应扩增出人红细胞生成素的基因片段，然后与克隆载体连接，克隆基因。另一种是提取人胎肝mRNA，逆转录合成cDNA文库，进行文库筛选，得到人促红细胞生成素基因。将人红细胞生成素基因与表达质粒重组，导入哺乳动物细胞，经筛选得到表达人红细胞生成素的细胞株。常用的表达载体有这两种质粒带有二氢叶酸还原酶（dhfr）基因，也可以用不含dhfr基因的表达载体。常用的宿主细胞为CHO细胞。构建载体经过筛选后，必须通过测序，确证红细胞生成素的DNA序列及其推导的氨基酸序列是正确的。3.1.2 构建表达促红细胞生成素的细胞株 以二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞系（CHO dhfr-）为宿主细胞。将此细胞培养于100 mm培养皿中，待细胞长满至50%60%时，用无血清细胞培养基淋洗细胞，加入由无血清培养基、表达载体和共转化载体，以及lipofectin组成的共转染混合液，37培养4小时。吸出培养基，加入含10%胎牛血清的F12培养基，37培养过夜。随后在含青霉素、链霉素及10%胎牛血清的DEME中培养，获得抗性克隆。逐步提高MTX终浓度，筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞表达人红细胞生成素。3.2 细胞培养工艺过程在获得了能够高效表达目的蛋白的重组细胞株以后，利用转瓶大量培养贴壁细胞4。3.2.1种子细胞制备（1）冻存的细胞株37水浴复苏，无菌离心，弃去冻存液。（2）加入适量DMEM培养基（含10%小牛血清）。（3）37二氧化碳培养箱培养，连续传三代。（4）细胞消化后接种，接种的细胞浓度约为2.5106个/ml。3.2 .2反应器连续培养（1）加入纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，5L细胞反应器高压灭菌1.5小时。（2）将反应器接入主机，连接气体，校正电极，排出PBS缓冲液。加含有小牛血清的DMEM培养基，接种。控制条件pH7.0，搅拌转速50 r/min，37，DO 50%80%，进行贴壁培养。（3）转速提高到80100 r/min，继续扩增培养10天。 （4）更换为无血清合成培养基，由软件控制温度、溶氧、pH值等培养条件，进行连续灌流培养。（5）收获培养物，48保存。3.2.3培养工艺控制2.3.1 搅拌速度在刚接种后细胞稀少时，搅拌速度缓慢，使细胞牢固地贴附于载体上，随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度，以便使细胞周围的微环境中代谢产物和营养物质都在较短的时间内达到平衡。2.3.2 温度 动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。因此，对温度的控制应较为严格。恒定的温度(37)及pH值(7.2)也是较为理想的条件。2.3.3 pH pH值也是细胞培养的关键性参数，它能影响细胞的存活力、生长及代谢。细胞生长的最适pH值因细胞类型不同而异，应先通过实验寻找出最适pH值，再通过输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。细胞生长与表达的pH值为7.07.2。2.3.4溶氧 氧是细胞代谢中最重要的养分之一。它可以直接和间接地影响细胞的生长与代谢。溶解氧应在10100的范围内。可根据需要向培养液内加入氧气、空气或氮气按比例的混合气体以控制溶氧。2.3.5营养成分 葡萄糖是细胞生长与表达过程中必不可少的碳源之一，其消耗程度直接反映出细胞代谢旺盛程度，细胞生长、表达旺盛时，需大量消耗，而缺乏时细胞生长速度与产物表达量均降低，故应及时充分地予以补充。此外还应监测氨、乳酸盐类等代谢废物在培养基中的含量，维持在较低的浓度，减少对细胞损害。3.4 红细胞生成素的分离纯化工艺过程用离心机去除培养基中沉淀物，经截留量10000分子量的中空纤维超滤器浓缩至1L，将浓缩的培养基经Blue Sepharose 6 Fast Flow 分离，先用20mmol/L,Tris-Cl,pH7.0,100mmol/L磷酸缓冲液平衡，上柱后用含盐的同一缓冲液梯度洗脱，收集EPO部分，用%20mmol/L,pH7.2 Tris-Cl缓冲液透析过液，再经Q-Sepharose柱分离，上柱后用含盐的Tris-Cl, pH7.2的缓冲液梯度洗脱，最后经分子筛层析精制。流动相为20mmol/L,Tris-Cl,pH7.2,100mmol/L的NaCl。4 重组人促红细胞生成素发展治疗性蛋白革命性地改变了很多疾病的治疗结果，但体内活性低和在体内的快速消除限制了其进一步使用。因此不少研发单位已经开始研发新型的促红细胞生成素。其中以新红细胞生成刺激蛋白(NESP)为代表，是美国Amgen公司研制的长效EP0制剂，2001年6月底获得欧洲药物评审委员会批准，也是第一个被批准用于临床的长效红细胞生成素。另外近年来还由法国学者Dalle等利用基因重组技术合成了一种二聚体EP0，由两个EP0及一个9肽连接而成的融合蛋白。有关研究表明不管是由化学交联还是由重组DNA介导的编码区融合而获得的两个EPO分子的耦联，都能比天然单体更稳定，体内寿命也更长的。另外还有一些研究者试图构建表达EPO与其他细胞因子的融合蛋白，比如血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)与EPO的融合蛋白，希望能用来作为肿瘤化疗的辅助治疗药物，同时也能纠正红细胞贫血和血小板减少症。 在国际上，人促红素由阿法依泊汀、倍他依泊汀和阿法达贝泊汀构成抗贫血药市场的三大寡头，垄断了促红细胞生成素95左右的市场份额。在国内，随着国内生物制药企业的兴起，近几年国内EPO产能已超过了500万支，国产品以价格优势占领市场，从而形成了以国产EPO为主流的市场格局。单2005年国内抗贫血药物市场的容量超过8亿元，EPO约占了该市场40的份额。近年来国内也有厂家开始进行二代rhEPO的研发和生产，还有一些生产厂家开始进行高水平制剂的研究，例如研究新型制剂no川。相信随着国家医改政策的深化和落实，人民生活水平的进一步提高，rhEPO的市场必将有进一步的扩大。参考文献：1 Fukuda M .Structure and role of carbohydrate in human erythropoitin in Molecular Biology of Erythropoietin J. New York: Plenum Press. 1989, 3一672 朱绿松，伞德忠，李振武，高晶，候晓薇，彭文广.重组人促红细胞生成素生产工艺研究J.药物研究，2001年第4期3 徐志利.重组人促红细胞生成素的制备及临床应用J.药学研