生物检测技术考试题.doc

这3道大题是每张试卷上都有的：1、聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。模板、引物、4中核苷酸、DNA聚合酶2、SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。各种蛋白质SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度3、免疫细胞：血液白细胞；血中T细胞与B细胞。 下面12道实验题只需要抽一道！实验操作1）请用离心方法分离出溶液中的沉淀（假设4，10000rpm离心5min）答：所需仪器设备：冷冻离心机、菌液、移液枪实验原理：当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的粘度有关。离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。操作过程：（1）取另外一支洁净的空离心管，将待离心液体均分成2个离心管，每个管等重，盖紧盖子对称放入转头。（2）拧紧转轴螺母，盖好盖门，将仪器按上电源后，打开仪器后面的电源开关。（3）按运行键启动仪器，仪器按出厂所设定的参数工作，数码管显示实际转速和温度；按制冷开关，温度数码管显示腔内实际温度。（4）调整运行参数：设定温度：按制冷功能键，使相应的（上限或下限）指示灯点亮，数码管即显示该参数值，数码管中有一位数字在闪烁，此时可用数字选择换位键和增键及减键相结合调整该参数直4，然后，按制冷开键，按一次制冷功能键，退出设定程序。设定运转时间和运转速度：可按功能选择键，使相应的指示灯亮，数码管即显示该参数值，此时可用数字选择换位键、增键、减键相结合调整该参数至10000rpm离心5min，并按记忆键确认。（5）仪器运行过程中数码管显示转速和温度，当需要查看其它参数时，可按功能键或制冷功能键，使相应的指示灯亮，数码管即显示该参数值。当仪器运行完所设定的时间后或中途停机，停机过程中数码管闪烁显示转速。2）提取肌肉组织的蛋白质，如何操作？ 答：所需仪器设备：离心机、真空干燥器或干燥箱、蒸发皿、离心管、烧杯、pH试纸、滴管、玻棒。实验原理：蛋白质因分子量大小不同而致化学性质不同，分子量较小的蛋白质可以溶于水中，一般的就称为水溶性蛋白；分子量偏大一些的在盐的作用下也能有溶于盐水中一般就称为盐溶蛋白，分子量再大一些的不能溶于水中。缓冲溶液中的盐能与蛋白质结合成稳定的螯合物而从组织中释放出来，从而将水溶性和盐溶性蛋白从组织中抽取出来，提取蛋白的结构、数量、活性与提取温度、pH、机械作用、酶的作用和溶液组成关系密切。操作过程：采集新鲜组织材料，洗净，晾干，根据样品重量（1g样品加入5-10ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。把样品放在研钵中用（植物需用液氮）研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）用离心机离心8000rpm40min4或11100rpm20min4提取上清液，样品制备完成。3）细胞台盼蓝拒染的原理与操作？答：所需仪器设备：微量加样器、离心管、台盼蓝染液、白细胞计数板、光学显微镜实验原理：正常细胞具有完整的细胞膜结构，而死亡的细胞其细胞膜机构被破坏。台盼蓝无法通过正常的细胞膜，因而正常的细胞不被台盼蓝染上，而死细胞则可被台盼蓝染成蓝色。台盼蓝拒染法是利用台盼蓝只能将死细胞染成蓝色而活细胞不被染上的方法检测细胞存活率的一种快速简便的方法。操作过程：收集细胞，稀释成一定体积。取一定体积的细胞，与一定体积的台盼蓝（V：V=1：9）混合2min。染色细胞加载于白细胞计数板，在显微镜下计数，染蓝及不染色细胞，计算细胞存活率。结果统计：镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。计算四个大方格中细胞数量，根据下式求细胞活力：细胞总数=四个方格总细胞数4105（个ml）活细胞率（%）=活细胞总数（活细胞总数+死细胞总数）1004）请你制作一块浓度为1%琼脂糖电泳凝胶。所需仪器设备：琼脂糖凝胶电泳系统、三角烧瓶、制胶槽、齿梳、核酸染料、电炉实验原理：琼脂糖加热到80以上即可溶解，在pH（8.0）高于其pI时，DNA分子带负电荷，在直流电场中DNA向正极泳动，冷却后（50），凝胶溶液加入的核酸染料与DNA分子结合，在紫外线照射下显示出荧光，便于对DNA进行定性或定量检测。操作过程：称取0.4g琼脂糖粉，加入三角瓶，加入40ml 0.5TBE电泳缓冲液，瓶口上倒扣一个小烧杯或小平皿，将该三角瓶置于微波炉或电炉加热直至琼脂糖溶解。注意观察三角瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉或电炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉或电炉中！）带上棉手套，从微波炉或电炉上取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50），再加核酸染料适量。胶板的制备：将有机玻璃内槽洗净、晾干，放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子。将冷却至50左右的琼脂糖凝胶液轻轻摇匀，小心地倒在有机玻璃内槽上，使胶液缓慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，这时在胶板上即形成相互隔开的上样孔。5）如何使用紫外透射观测仪观察凝胶上的条带。答：所需仪器设备：紫外透射仪、一次性手套、照相机（成像仪）、吸水纸操作过程：（1）将仪器接通电源，电源插座与仪器的插头相连。（2）接通总电源开关。（3）紫外光可通过开关控制通断，确定所需的光源后应稳定1-2min即可使用。（4）将样品置于工作台上，进行观察和照相。（5）使用完毕后，先关闭各灯开关，再关闭总电源开关，洁净仪器。（未清洁仪器扣10分）6）用移液器吸取酶液时应注意哪些问题？请回答并演示答：所需仪器设备：移液枪、酶液、冰盒实验原理：酶是一种生物催化剂，容易失活，所以在量取酶制剂时要注意尽量保持酶的低温状态，并且要将吸取出来的酶尽快地到达反应体系中。操作过程：液体置合适支架上。（如是酶，从冰箱取出后应立即插入冰块中）微量移液器调节到需要的体积。上紧吸头，插入液体液面下0.5cm，轻柔释放弹簧，吸取需要的体积，打出时全部释放出来。丢弃吸头，将弹簧放至最大。液体放回原处。（未用冰盒者扣20分！）7）阐述光学显微镜的使用方法？答：设备仪器：显微镜、载玻片（细胞计数板）、拭镜纸（1）显微镜的拿取与放置。右手握住镜臂，左手托住镜座把显微镜放在试验台上，略偏左（显微镜放在距试验台边缘7cm左右处）。安装好目镜和物镜。（2）对光转动转换器，使低倍物镜对准通光孔（物镜的前端与载物台要保持2cm的距离）。把一个较大的光圈对准通光孔。左眼注视目镜内（右眼睁开，同时画图）。转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒内。通过目镜，可以看到白亮的视野。（3）观察把所要观察的玻片标本放在载物台上，用压片夹压住，标本要正对通光孔的中心转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（眼睛看着物镜，以免物镜碰到玻片标本）左眼向目镜内看，同时反方向转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升，直到看清物像为止。再略微转动细准焦螺旋，使看到的物象更加清晰。注意事项：实验完毕，把显微镜的外表擦拭干净。转动转换器，把两个物镜偏到两旁，并将镜筒缓缓下降到最低处。最后把显微镜放进镜箱里，送回原处。8）叙述721分光光度计的使用方法？仪器设备：721分光光度计、玻璃比色杯、拭镜纸原理：溶液中的物质在光的照射激发下，产生对光的吸收效应，物质对光的吸收具有选择性，根据朗伯比耳定律，光能量减弱的程度与物质的浓度有一定的比例关系。答：（1）接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10min（2）将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。）（3）根据所需波长转动波长选择钮。（4）将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。（5）在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向T=0处。（6）盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的T=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿。分别读出测定管的光密度值，并记录。（7）比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。9）考马斯亮蓝法测蛋白含量的原理和操作方法步骤？答：仪器设备：可见分光光度计、玻璃比色杯、蛋白质溶液、考马斯亮蓝G250染料。实验原理：考马斯亮蓝G250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比。大大提高了测定蛋白质的灵敏度（1ug）实验步骤：（1）标准曲线的制作取试管6支，分别吸取不同含量的标准蛋白质溶液1Xml，用水补足至1 ml，再加入5.0ml考马斯亮蓝G250试剂，充分振荡混合，放置5min后，测定A595值。用1 ml加5.0ml考马斯亮蓝G250混合液调零。以测定管的A595nm为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线。（2）样品测定：取三支试管，分别加入不同含量的样品蛋白溶液1Xml，用水补足至1ml，再加入3.0ml考马斯亮蓝G250试剂，充分振荡混合，放置5min后，测定A595值。根据A595值，从标准曲线上查找样品蛋白的含量，取均值。10）如何制备一个20ul的PCR反应体系？ 仪器设备：PCR仪、微量加样器、2PCR Mix、ddH2O、引物、模板PCR原理：在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。答：取PCR管，分别加入10ul PCR Mix， 上、下游引物各1ul，1 ul模板DNA，用灭菌水补足体积至20ul，混匀，离心甩到管底。加入PCR仪扩增。11）竞争ELISA检测抗原的原理是什么？答：仪器设备：ELISA试纸、待测标本原理：标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。操作：样本制备加样结果判断12）外周血淋巴细胞分离的原理，为什么要加