细菌内毒素检查法常见问题与探讨.docx

此文章来源： /s/blog_4fcb513e01000bgj.html 细菌内毒素检查法常见问题与探讨 摘要: 目的 总结归纳细菌内毒素检查法中的常见问题，方法 收集整理工作中发现的问题，查阅国内外有关文献资料，对照分析应用情况并比较其差异。结果与结论：从五个方面较为全面的总结了细菌内毒素检查法所涉及到的问题，认为在应用方面还需要进一步完善、规范。关键词：细菌内毒素检查法；问题Discussion of common issues in the Bactaril Endutoxin Test, BETZHOU Su-Wen.（ Pharmacology Laboratory, Hubei Institute of Drug Examination, Wuhan 430064）ABSTRACT: OBJECTIVE to summarize and conclude the common problems in the bacterial endotoxins test. METHODS by collecting the practical problems in work and referring to the related articals and information, we compared and analyzed their differences. RESULTS and CONCLUSION the problems concerning the bacterial andotoxins test were comprehensively generalized in the review from five aspects and the conclusion showed that the application of the bacterial endotoxins test need to be further enhanced and standardized.Key word: Bactaril Endutoxin Test； problems 细菌内毒素检查法(Bactaril Endutoxin Test,BET )是近二十年来发展起来的用于检测药品及其中间品中内毒素污染的一种方法；作为家兔热原检查法的一种替代，已经十分成熟，美国药典迄今已为八百余种药品制定了该项检查法，中国药典自1990年版开始收载以来，每版药典细菌内毒素检查品种也逐步增多，2005年版已增加到204种，并且在增补本中将继续增加收载数量，该方法相对家兔热原检查法而言，有劳动强度低、快捷、经济、灵敏和易于标准化等优点，受到广大药品质检人员高度关注。2005年版药典在2000年版药典基础上在方法学、结构及细节上均进行了重大修订，使其更加规范、合理。 由于该方法本身是一复杂的酶促反应过程，试验步骤比较多，每个品种的限值制定和试验过程中涉及到的标准品、鲎试剂、检查用水及干扰因素等，均会给对实验结果造成不同程度的影响，以下是笔者近年来在药品检验过程中发现的较为常见的问题进行的汇总, 以期对实际工作具有参考价值。1、标准及限值的制定一个品种的标准及限值制定的妥当与否，直接决定了对药品本身质量的评价要求，标准要求太高、限值过严，往往影响产品的合格率，太松则不能保证药品质量，危及临床用药安全。为此，各国药典均提出了基本的制定原则，除特殊情况需要说明外，一般注射剂均按人最大致热阈值和人临床每小时每公斤体重最大使用剂量的关系来确定，即L=K/M（通常静脉给药的K值为5Eu/kg，M为人每小时每公斤体重最大使用剂量），而大输液(100-500ml) 的限值各国基本是一致的，无论是复方还是单方，均可按单位体积中所含内毒素的量来控制，（一般按 0.5Eu/ml）；看似简单的问题，在执行中却经常出现各种各样的问题。常见问题举例如下：11应以重量(mg)表示的错用体积(ml)表示 注射用更昔洛韦钠，按公式计算，其限值应为1.0 Eu/mg，但生产单位要求改为0.5Eu/ml，且未提供任何制定理由，也未说明稀释方法。使检验人员无法操作。12 不按人临床用量计算，按热原剂量计算 精氨酸阿斯匹林，若按人临床用量计算其限值应为0.3Eu/mg，但检查法制定中却按热原剂量计算为0.03Eu/mg，严格了10倍，因浓度较高，出现了干扰，给试验带来了麻烦。13随意放宽标准 有的新药研发单位对自己的产品没有信心，或按规定的限值不能过关（检验不合格或有干扰），则将标准随意放宽，如：谷氨酰胺注射液，美国药典规定限值为0.5Eu/ml，研发单位自行改为“稀释6倍后，按0.5Eu/ml。”，放宽了6倍，且未说明理由。14 照搬错误的标准 一品种限值根据其临床用量计算应为5Eu/mg，但已有暂行国家标准，限值为75Eu/mg，厂家则要求改为75Eu/mg，实际上第一个厂家所报标准没有根据，但由于漏审或未经专业人员审查直接变成了国家标准，此类标准太松。无法控制质量。15 相同品种具有不同的国家标准 在2004年全国大输液抽样检验的500批样品中，细菌内毒素检查和热原检查标准较为混乱，有的采用家兔热原检查法，有的则是细菌内毒素检查法，且部分内毒素检查法同一品种限值却不一样。例如：克林霉素磷酸酯注射液，有的标准限值规定为0.5 Eu/mg，有的则为0.6 Eu/mg 。16 随意修改，将正确的改为不正确 某一注射用药品，某省所在进行方法学研究时，按临床用量计算后将限值定为60Eu /mg；申报单位在资料汇总时改为：“取本品，加水5ml，再稀释8倍，每瓶含内毒素的量不得过100 Eu”。（本品规格为：10mg/支，人用量5mg/次）。尽管修改后的标准较之修改前严格了，但对标准的修改没有提供任何支持的实验数据。此外，该标准尚存在三处明显的错误，其一是没有注明细菌内毒素检查用水，而是仅仅描述为加水。其二是没有规定具体的药品规格，只是描述为“每瓶含”，忽视了每瓶可能带来的规格问题。其三则是限度的规定尽可能不使用类似“不得过”的描述，目前更准确的描述多采用“应小于.”17 检验方法表述不清楚 紫杉醇注射液：“取本品，加细菌内毒素检查用水至少稀释40倍后，依法检查（附录2000年版 E），每ml中含内毒素的量应小于2.4Eu”；此类表述很容易引起理解上的错误，是原液中的限值为2.4Eu /ml，还是稀释后每ml中应小于2.4Eu？无经验的操作人员往往会认为是后者。此类问题，2002年全国药理室主任会及05年版内毒素品种扩大会议已有统一意见，不提倡如此写法，因不同厂家、不同工艺生产的同一品种样品往往干扰程度不一致，稀释倍数就不一定相同（特别是中草药注射剂）。18 在药典标准中出现原料药与制剂限值不一致， 阿米卡星（制剂）0.33Eu/mg，原料2.2Eu/mg，前者是计算值，后者如何得来，不得而知。（已将后者勘误纠正为0.33 Eu/mg）19 用灭菌注射用水代替细菌内毒素检查用水 某质量标准记述为：“取本品，加灭菌注射用水10ml溶解后，依法检查”。此类标准往往是按说明书上临床用法照搬而来的。2、检查方法及干扰试验21样品检查 在对样品进行检查时，由于研发单位对检验人员的专业技术培训不够，使得操作者对标准及操作中的基本概念区分不清，理解有误。例如：211 0.5ml/支装量与灵敏度0.5Eu /ml的鲎试剂， 0.5Eu/ml与0.5EU/mg限值的概念不清。21. 2 配制样品溶液时，在理解限值（L）与鲎试剂灵敏度 ( ) 的关系问题上概念模糊，如：青霉素限值为0.01Eu/100u；有的用户就认为一定要0.01Eu/ml灵敏度的鲎试剂；又如甲硝唑注射液，过去的标准限值0.35Eu/ml，就要求买0.35Eu/ml灵敏度的鲎试剂。21. 3 不管品种性质是否适合将家兔热原检查法改为内毒素检查法，从而导致了标准上的不统一和结果的不一致。如：中草药注射剂，一些新生物制品，某些医疗器材等，它们造成的发热可能不仅仅是内毒素，可能还有多糖核苷酸，高分子抗原或半抗原等非内毒素热原，细菌内毒素检查不能检测出该类物质，一味地将这类产品改为BET，在临床上可能就存在热原反应的隐患。22干扰试验 在对某一品种建立细菌内毒素检查法的过程中，干扰实验是十分重要的环节，只有证实该品种不存在干扰或去除了干扰，才能用于日常的检验。干扰的类型主要表现为抑制干扰和增强干扰。很多实验室的经验表明绝大部分的干扰因素来自于样品，如：不同来源的原料、生产工艺的改变，导致样品的PH、样品的成分、样品的浓度等变化。因此，即使来自不同厂家的同一品种，其生产质量也不尽相同，所以应该要求每个生产厂家在报批时均应提供有关方法学的研究报告。表现在方法学验证及样品最大无干扰浓度上的问题主要有：22. 1 认为国内或国外已有生产的品种，方法学验证就可以不做。造成大量的新药标准特别是仿制药未做系统的干扰试验。22 . 2 认为一定要按最大有效稀释倍数（Maximum valid dilution MVD）或最小有效浓度（Minimum valid concentration MVC）进行实验。实际上，有的样品浓度很高也不干扰鲎试剂与内毒素的反应，这种情况下，只要样品内毒素含量合格，可以在MVD范围之内，即小于MVD的倍数下进行试验，如果一个样品在小于MVD的情况下试验时样品阳性管有干扰，或样品管为阳性，可再按MVD进行相对应的稀释重新试验.3、与国外标准的差异31.单次试验鲎试剂的加样鲎试剂的规格分单次试验瓶（STV）及多次试验瓶(MTV)两类。目前世界上除中国外其它国家STV的使用都是直接加0.2ml样品溶液复溶试剂兼检查。中国药典对STV要求是先加0.1ml BET水复溶，再加0.1样品溶液作检查。32.工作标准品的效价标定 内毒素工作标准品(CSE)的效价标定有两种方法，一种是浮动效价标示法，另一种是固定效价标示法。浮动效价标示法对每批号CSE只标示它的含量（重量，如mg, ng等），当这批号CSE确定配那一批鲎试剂使用时，鲎试剂厂家才向用户提供一份效价测定证书(Certificate of Analysis, CoA)，给出使用该批号鲎试剂测定的RSE/CSE比率以及该批号CSE的效价。固定效价标示法是以某一批（或数批）鲎试剂测定该批CSE的RSE/CSE比率，从而计算出该批CSE的效价。例如，某批鲎试剂对某批CSE的RSECSE比率是8Eu/ng，该批CSE的装量是10 ng/支，则CSE的效价就是8Eu/ng10ng/支80Eu/支，以此作为该批CSE的标示效价。目前欧美国家采用的是浮动效价标示法，我国采用的是固定效价标示法。以上两种效价标示方法都有所长和不足，其应用背景也不尽相同。 严格说来，中国的工作标准品和美国的工作标准品在定义上不完全一致，中国药典对内毒素工作标准品的定义是：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于实验中鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和设置的各种阳性对照。美国内毒素工作标准品最初的使用是源于国家标准品的费用较高和对国家标准品的潜在消耗，建立工作品的主要目的是作为国家标准品的替代品，用于日常内毒素检测工作的，由于美国实行鲎试剂批批检制度，因此工作品不用于鲎试剂灵敏度的复核，主要是用于设置各种阳性对照（阳性对照和供试品阳性对照）和确证试剂、实验材料和操作方法的可行性；FDA对工作品不进行控制，由生产厂家自行生产和管理。 在我国，现阶段对鲎试剂的灵敏度没有进行批批检定，鲎试剂的出厂检验一直是由厂家自行按部颁标准进行；由于各鲎试剂厂家之间的生产条件、工艺技术水平还存在一定差异，很难保证每一批鲎试剂的灵敏度都符合标准，为此规定用户在使用前用统一的工作品复核灵敏度；应该说，中国的工作标准品除了有“工作”的含义外，还有一定意义上的“监控”作用。基于此，就现阶段来说，我们还无法评价国内外这种标定差异上的利与弊，期望今后能在不断的实践过程中，能找出更为有效的、合理的办法。3.3 对供试品溶液pH要求中国药典BET法对供试品溶液的pH值要求在6.08.0的范围内。但实际上，有许多样品溶液的pH值不在此范围内也对BET不造成干扰，原因是鲎试剂本身有缓冲能力。事实上，应该这样认为：一个供试品是否要调节pH值，应根据干扰试验的结果来判断。如果该供试品对BET有干扰，且干扰的原因是由pH值不适宜造成的，才有必要调节供试品的pH值。美国药典BET法对供试品溶液pH的要求是：测定供试品溶液与鲎试剂溶液的等体积混合液的pH值，应在6.08.0范围内。这意味着当供试品溶液的pH值的影响超出了鲎试剂的缓冲能力时，才需要去调节供试品的pH。4、关于细菌内毒素检查用水 2005版药典规定凝胶法用细菌内毒素检查用水内毒素的量应小于0.015Eu/ml ，对使用灵敏度为0.5Eu/ml的鲎试剂没有多大问题，但如果用0.03Eu/ml的鲎试剂则可能存在问题。如果试验结果为阳性，则应慎重考虑。5 、其它5、1不宜建立BET的品种 根据本实验室经验 ： 5.1.1中草药注射剂，由于中药成份复杂、干扰因素多、同一品种样品往往干扰程度不一致，且阳性率偏高；如炎琥宁，复方丹参注射液、红花注射液、紫杉醇注射液等。5.1.2部分生物制剂及钙镁离子鳌合剂，酶抑制剂等5.2需要处理的品种5.2.1 不适宜的pH条件，如样品的 pH值偏高或偏低，可用碱性或酸性缓冲液来调节至合适的pH值范围，或采用高灵敏度鲎试剂进行相应稀释后来解决。浓度较高的氨基酸品种及部分抗生素品种均可通过通过以上方法来解决干扰。5.2.2 由于鲎试剂中促使凝胶形成的丝氨酸蛋白酶可以被多种化学