植物细菌学.doc

细菌鞭毛:是着生在细胞表面的细长、波曲的丝状结构，由基体、钩形鞘和鞭毛丝三部分组成，是细菌的“运动器官”。 胞外多糖：许多菌系有荚膜，在培养基上形成质地粘稠菌落，产生的大量荚膜多糖就叫做胞外多糖。 革兰氏染色：用结晶紫染色和碘液处理后，再用酒精或丙酮洗后，不褪色的是G+（保留紫色），洗后褪色的是G-（褪色，复染成红色）。 遗传性：细菌在一定的培养条件下生长繁殖，通过DNA的自我复制，将各种性状相对稳定地传给子代，这些性状在亲代与子代间表现相同。 变异性：在细菌繁殖过程中，当外界环境条件发生变化或细菌遗传物质结构发生了某些改变时，细菌原有的性状也随之发生相应的改变。 寄生性：绝大多数的植物病原细菌都不是专性寄生菌，寄生性是有差别。寄生性有强有弱，寄生性强的可以侵染植物绿色组织；寄生性弱的大多侵染贮藏器官或抵抗弱的部位。另外，植物病原细菌的寄生专化性也有差别。 致病性：病原物所具有的破坏寄主并引起病害的特性。致病性易丧失。 毒素：主要破坏寄主细胞的半透性，造成原生质中不溶性物质转变为可溶性而外渗，造成细胞水分、养分向间隙外渗，引起腐烂或斑点症状，初期水渍状症状。 细菌种：由一些具有许多共同特征的菌系组成的群体，通常这些菌系和其它菌系有很大区别。或一个具有高度的表现型相似性和在许多重要特征方面与有关菌系存在一定差异的组群。 菌系：由分离获得的纯培养物的单个菌落繁衍的后代组成。 参考菌系：又称典型菌系，是一个种的核心，由它以及和它相似的其它菌系组成种。 亚种：是命名法规中承认的最低分类阶元且具有合法的名称。亚种是种下在次要性状方面具有稳定变化的组群，这些组群的划分可以具有遗传学依据。 变种：在亚种以下某一生物学性状有明显稳定变化的群体，在植物病原细菌中称这些变种为生物变种、血清变种等。 致病变种：表示一种细菌在一系列细菌学特征方面具有总体相似性，但也不排除在少数特征上存在差别，重要的是它们对不同寄主植物表现不同的致病性。 类支原体菌（MLOS）：现为植原体是一类引起植物“黄化类型”病害的非螺旋形支原体菌体的形态为多形性，圆形、椭圆形等，与支原体属类似，故将其归为一类，称为类菌原体。 抗原：能引起免疫反应的异体物质称为抗原。 抗体：是在抗原刺激下产生的特异球蛋白，又称免疫球蛋白，能识别相应抗原，并与抗原进行特异性结合。 血清反应：抗原和抗体在生物体内和体外都能发生免疫反应。细菌分类鉴定中常在体外采用血清中的抗体进行，含有特异性抗体的血清称抗血清或免疫血清，这种反应又称血清反应。 特异性抗原：在细菌的抗原中，有些是细菌种、亚种或型等所特有的，称为特异性抗原，可用于细菌鉴定与分群分型。 共同抗原：有些抗原是一类或一属细菌所共有的称为类、属抗原或共同抗原。同时含有两类抗原的细菌能刺激肌体产生相应的两类抗体。 多价噬菌体：寄主范围广，可侵染一个属中不同种的细菌。在研究细菌的亲缘关系上有一定意义。 单价噬菌体：寄主范围窄，只侵染同一种细菌的个别菌系。一般植物病原细菌鉴定利用单价的专化性噬菌体。 变性：双链DNA在一定条件下，互补的双链分开。 复性：适当条件下分开的双链重新配对组成双链。 DNA杂交：不同细菌的DNA分子变性后令其复性。或异源DNA单股螺旋重新结合成双股的过程。 核酸杂交：核酸杂交技术根据碱基互补配对原理，将两条不同来源的单链核酸进行复性以鉴定菌株间的亲缘关系，包括DNA-DNA（Southern杂交）、DNA-RNA、RNA-RNA（Northern杂交）。 分子杂交：是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。 ITS区域：又称转录间隔区，位于原核生物23s rDNA、16s rDNA和5s rDNA之间，包括一些tRNA基因和非编码区域。 PCR（聚合酶链反应）：是一种由特定寡核苷酸（引物）介导的特异基因或克隆序列的体外酶促扩增技术。 RAPD：运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD。 RFLP分析：是用不同限制性内切酶消化PCR产物或细菌染色体DNA产生不同长度限制性片断的酶切图谱，将图谱与已知菌进行比较鉴定细菌。 强寄生菌：侵染植物的绿色部分，自然孔口入侵。 弱寄生菌：侵染植物的贮藏器官或抵抗力较弱的部位。 致病性毒素：主要破坏寄主细胞的半透性，造成原生质中不溶性物质转变为可溶性而外渗，造成细胞水分、养分向间隙外渗，引起腐烂或斑点症状，初期水渍状症状。 G+C mol%：是指细菌DNA水解产物中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）在总核酸碱中所占的摩尔百分比，简称为G-C。 植物菌原体：与植物病害有关的统称为植物病原体，包括螺原体属和类支原体菌。 植物病原细菌研究热点：致病机理和致病性分子遗传、植物病原细菌与寄主之间的互作关系。 细菌的营养:光能无机自养型、光能有机异养型、化能无机自养型、化能有机异养型（植物病原细菌）。 细菌的代谢：无氧发酵、有氧呼吸（EMP途径和三羧酸循环相结合）。 细菌的代谢产物：糖发酵试验、吲哚试验、硫化氢试验、 V.P.试验（产生3-羟基丁酮试验）。 培养基种类：按组分分为 自然、合成、半合成培养基。 按用途分为 基本培养基、特殊培养基。 按培养方式分为 液体培养基、固体培养基。 菌原体病害的症状特点：丛生、矮缩、小叶、黄化。 细菌病害的症状特点：坏死、萎蔫、腐烂、畸形。 细菌菌种保存：目的是使菌种不混乱、不死亡、不污染。 细菌菌种保存：转管保藏法、液体石蜡油保藏法、无菌水保藏法、真空冷冻干燥保藏法。 寄主植物识别细菌的主要组分：脂多糖。 变异类型：表现型变异、遗传性变异。 变异机理：基因突变、基因的转移和重组（转化、转导、接合、转座因子）。 细菌门类划分：薄壁菌门、厚壁菌门、软壁菌门、疵壁菌门。 Ti质粒功能：控制细菌的致病性、控制对细菌素agrocin84的敏感性和寄主范围、作为高等植物遗传工程的优良基因载体。 人工接种方法：喷雾接种、刺伤接种、注射接种、摩擦接种、浸泡接种、切伤接种。 细菌的抗原物质按细菌结构分为：荚膜、鞭毛、菌毛、菌体抗原。 植物病原细菌研究中应用的抗原：非纯化抗原、纯化抗原、已鉴定的纯化抗原。 血清反应基本特征：具有高度特异性、灵敏度很高。 血清反应主要类型：凝聚性反应（凝聚反应、沉淀反应）、标记抗体技术（酶标记抗体、荧光标记抗体、同位素标记抗体）、单克隆抗体技术（特异性很高）。 核酸杂交分为：液相杂交、固相杂交。 双链DNA探针的合成方法：切口平移法、随机引物合成法。 PCR步骤：变性、退火、延伸。 PCR反反应条件：温度、时间、循环次数。u 细菌运动器官细菌鞭毛（flagellum）是着生在细胞表面的细长、波曲的丝状结构，由基体、钩形鞘和鞭毛丝三部分组成，是细菌的“运动器官”。除鞭毛外，有些细菌的细胞表面还着生一些比鞭毛更细、更短的、中空的丝状结构，叫纤毛。纤毛不是细菌的“运动器官”鞭毛和纤毛均由蛋白质组成。u 菌原体病害的症状特点病株矮化或矮缩，枝叶丛生，叶小而黄化。因此丛生、矮缩、小叶与黄化相结合是诊断菌原体病害症状时必须掌握的关键。u 细菌病害的症状特点病植物表现的症状类型主要有坏死、萎蔫、腐烂和畸形等4类，褪色或变色的较少;有的还有菌脓(ooze)溢出。u 细菌的细胞结构与功能胞外多糖（ EPS）位置：细胞的最外层作用：防止细菌干燥，保护细菌免受外界侵害，为细菌聚集矿物元素和营养，在寄主-病原细菌相互作用中起重要作用。结构特征：多个亚单位组成的多聚糖，包括异聚糖类和同聚糖类。同聚多糖：-1,2-葡聚糖（根瘤菌），纤维素（土壤杆菌、根瘤菌），果聚糖（欧文氏菌、假单胞菌），藻酸盐（荧光假单胞菌）异聚糖：酸性多聚体（包括中性糖、糖醛酸、非碳水化合物置换基团），在决定植物病原细菌致病性中的作用。青枯假单胞：EPS产量与细菌致病性强弱正相关，是引起萎蔫的重要因素。甘蓝黑腐黄单胞：EPS是调节致病性的生化因子之一。梨火疫欧氏杆菌：产生果聚糖和amylovoran。果聚糖可能在病害初期起作用Amylovoran在细菌定殖过程中起重要作用。在寄主-病原菌识别中的作用寄主植物识别细菌的主要组分是脂多糖，丰富的胞外多糖对寄主的识别作用有遮掩作用。脂多糖 位置：细菌的外壁层，内接细胞壁肽聚糖，外连胞外多糖或荚膜多糖。特点：革兰氏阴性细菌特有结构，决定细菌的免疫学特性 决定对噬菌体的敏感性，影响与寄主的相互关系。结构特征：极为复杂的分子，分子量在10000 u以上。功能：血清学反应：脂多糖的O侧链区又称为O抗原区，是脂多糖的独特部分，在细菌血清学反应中起决定作用。吸附与识别：如大白菜软腐病菌，大白菜幼根上有LPS的吸附位点。与噬菌体吸附的关系：G细菌的提取物含有LPS，它的O抗原部分和核心区都可以吸附噬菌体并使其钝化，还可以诱导噬菌体释放出核酸。障碍功能：G细菌的细胞壁外层对于某些物质进入菌体的环境中是一道障碍。细胞壁外层的脂多糖在这种障碍功能中起着主要的作用。细胞壁 成分：肽聚糖功能：肽聚糖是决定细胞形状的主要因素，溶菌酶催化的溶菌作用，即破坏了肽聚糖纤维的完整性。青霉素对含肽聚糖原核生物的生长繁殖的致命影响，也在于抑制肽聚糖合成的最终步骤即肽链交联。致病性：病原物所具有的破坏寄主并引起病害的特性。致病性易丧失。毒素：主要破坏寄主细胞的半透性，造成原生质中不溶性物质转变为可溶性而外渗，造成细胞水分、养分向间隙外渗，引起腐烂或斑点症状，初期水渍状症状。酶 果胶酶：分解细胞壁，引起崩解，多引起腐烂。蛋白酶：使寄主细胞失活、坏死，引起坏死症状。水解酶：分解碳水化合物造成细胞死亡，引起斑点。多糖类物质许多细菌可产生高分子量的多糖物，阻塞导管，引起萎蔫。激素引起畸形，癌肿。植物病原细菌的侵染及传播u 侵染来源种子和无性繁殖材料（块根、块茎、种苗）；带菌的土壤和肥料：青枯菌、根癌土壤杆菌；病株残体（土壤、肥料）；杂草和其它作物；昆虫介体。u 侵入途径自然孔口侵入：风雨、雹、冻害、昆虫等造成；气孔：如棉花角斑病。水孔：如水稻白叶枯病和甘蓝黑腐病的病原细菌。蜜腺：梨火疫病。伤口侵入：根癌土壤杆菌、格兰氏染色阳性棒形杆菌、软腐果胶杆菌。以维管束病害为多。人为伤口：耕作、施肥、嫁接、移栽、疏芽、疏果、打顶、收获、运输等造成。从自然孔口侵入的细菌一般都能从伤口侵入，反之不一定。蔬菜软腐病和只能从伤口侵入，很少从自然孔口侵入。叶毛(leaf hairs)梨火疫病菌可经由未受伤的叶毛侵入。假单胞杆菌和黄单胞杆菌。（气孔、水孔、皮孔、蜜腺）u 细菌侵入后的蔓延细菌侵入寄主组织后，不能直接侵入寄主细胞，先在组织的细胞间隙繁殖或在导管中繁殖，当寄主细胞受到损伤或死亡后，再进入细胞。u 传播途径雨水（露）：植物病原细菌最主要的传播途径。灌溉水。介体：类菌原体、介体昆虫。人类活动（人为传播）：种子、苗木调运、农事操作（工具带菌、伤口）稻白叶枯病、细条病种子调运 马铃薯环腐病切刀传染。u 细菌主要门类划分（被分为4门，7纲，35组群）薄壁菌门：主要由革兰氏阴性菌（G-）组成，2层壁，内薄外厚，肽聚糖少只局限于内层。厚壁菌门：主要(G+)菌组成，一层壁，肽聚糖量高。软壁菌门:主要由支原体类细菌组成，无壁，不含肽聚糖，菌体四周由单位膜包围。疵壁菌门:一类没有进化的原始细菌，也称古细菌。菌体细胞壁中既无肽聚糖，又无胞壁酸。u 命名（双名法）亚种命名：属名种名subsp. 亚种名定名人定名时间。致病变种命名：属名种名pv. 致病变种名定名人定名时间。u 植物病原细菌的确定步骤通过显微镜的检查，在染病组织中有细菌存在；分离病原细菌并获得纯培养；人工接种测定致病力能产生原先所表现的症状；自接种后发病的组织进行再分离，所获得菌种与原先菌种进行比较是一致的；形态染色，培养特征的观察，生理生化反应的测定。u 植物病原细菌鉴定的步骤植物病原细菌鉴定的步骤显微镜检查喷菌现象（BE）首先要根据症状类型的特点选取；以灭菌剪将病斑剪下，略带健康组织，放在灭菌载玻片中央，加无菌水1d；然后以灭菌剪或解剖针将病斑自中心撕破，加上灭菌盖玻片，静置，有云雾状自破口处涌出。分离分离方法（划线分离法、平皿稀释法）。不同症状类型病原细菌的分离。1）斑点型：首先用灭菌剪刀剪取新病斑，乙醇中消毒，消毒后用灭菌水洗涤，用划线法或稀释法进行分离培养。2) 萎蔫型：酒精轻拭，在火焰上消毒，挤出溢脓或汁液，分离。3) 肿瘤组织 酒精擦拭表面，在火焰上消毒，再在灭菌皿中实行解剖，划线或稀释分离。4)腐烂组织较简单，选择近病部交界处以接种环挑取少量腐烂组织，稀释后划线分离5)种子带菌的分离选择病种子，汞液表面消毒，灭菌水洗涤，再酒精中浸几分钟，洗涤，取出放在研钵中磨碎，稀释培养。细菌的纯化典型单菌落平板划线培养细菌菌种保存（减少污染的前提下降低细菌代谢活动）定期转管：土壤、假单胞杆菌每月1次，黄单胞和棒形细菌2 3周1次。液体悬浮。矿物油：使液体石蜡超过培养基顶端1cm，冰箱保存，至少可保持活力几个月。保存好氧菌效果较好。冷冻干燥：目前最好法，可保持活力数年以上。其它：超低温、瓷珠保存和明胶片保存。u 常规致病力测定的步骤细菌繁殖：通常培养在固体培养基上，菌龄2448h； 菌悬液：0.85盐水配，光电比色计、计数板计数；植物选择：首先应选择分离的植物与品种；也可选寄主范围内的代表植物；有的可选择指示植物。接种部位选择：原则上发病器官接种。u 人工接种的方法喷雾接种（普通、高压喷雾）对于从气孔、水孔等孔口侵入的，造成叶斑类型的细菌。刺伤接种。主要用于伤口侵入茎和肉质器官的腐烂类，接种效果较好，也用于焦枯、坏死、萎蔫等。注射接种。可用于萎蔫、叶斑、肿瘤等症状类型。磨擦接种。对叶斑类病害。浸泡接种。对萎蔫型和苗期病害。切伤接种。腐烂类除针刺接种外，也可用此法。u 革兰氏染色原理：革兰氏阳性菌：壁厚、肽聚糖含量高。革兰氏阴性菌：壁薄、肽聚糖含量低。染色过程：固定结晶紫染色1 min碘液处理1 min 95%酒精褪色30 s 番红复染10 s。快速方法：Cerny据氨基酶颜色反应（G+无此酶、G-有，反应后呈黄色）。3KOH试验（G-壁被分解，粘绸；G+壁不分解。u PCR：步骤：模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链（以便它与引物结合，为下轮反应作准备）；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。注意事项：引物量：每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度：目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。PCR污染与对策PCR反应的最大特点：具有较大扩增能力与极高的灵敏性。PRC污染：污染原因：标本间交叉污染；PCR试剂的污染；PCR扩增产物污染；实验室中克隆质粒的污染。污染的监测：对照试验；阳性对照；阴性对照；重复性试验；选择不同区域的引物进行PCR扩增。防止污染的方法：合理分隔实验室；样枪；预混和分装PCR试剂；防止操作人员污染；使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用；设立适当的阳性对照和阴性对照；减少PCR循环次数。u 分子生物学和遗传学方法16s rRNA序列分析：细菌核糖体中含有23s、16s和5s三种类型的rRNA，其中16s rRNA基因序列作为生物系统发育指标较适合。依据：16s rRNA为细胞所共有，分子大小适合操作，功能同源且最古老，既含保守序列又含可变序列。5s rRNA含核苷酸少，携带的遗传信息不足以用于分类研究。23s rRNA含有的核苷酸量大，分析较困难。基本原理：提取细菌样品中的总DNA用16s rRNA通用引物PCR扩增得到16s rRNA序列。PCR产物克隆到质粒载体上，测序序列分析（BLAST）一般认为两个细菌的16s rRNA同源性大于99，且染色体DNA杂交值大于70，在基因水平上则认为是同一种细菌多个细菌的16s rRNA基因序列经多序列联配、比对后可以建立起一个系统进化树，用于表达各细菌之间亲缘关系的远近。u 土壤杆菌属特征：菌体杆状，单生或成对，鞭毛周生1-6根；土壤习居菌，好气性；G-，无芽孢，菌落圆形光滑，质地粘稠无色素；过氧化氢酶阳性，氧化酶通常也是阳性。发病：除放射状土壤杆菌外，土壤杆菌属细菌从伤口侵入植物根冠、根和茎部，引起冠瘿、发根和茎瘿瘤（菌株带Ti质粒引起冠瘿症状；带Ri质粒引起发根症状）。土壤致病菌系，从伤口侵入植物后，致病的Ti质粒的一部分T-DNA可以转入并整合到寄主基因组中。u Ti质粒功能控制细菌的致病性，控制对细菌素agrocin84的敏感性和寄主范围，作为高等植物遗传工程的优良基因载体。u 常见假单胞菌主要有三类溶果胶的荧光假单胞细菌：弱寄生菌，引起马铃薯和贮藏期蔬菜的腐烂。定向假单胞型细菌：包括许多致病变种，可以用致病性和生理生化试验测定，大多数致