淀粉酶产生菌的筛选、培养与选育.doc

功能微生物（淀粉酶产生菌）的筛选、培养与选育22100934 程雅楠摘要：以产淀粉酶细菌的筛选和选育为目标，通过培养基制备及灭菌、菌种的分离筛选与纯化、菌种的鉴定、培养条件的优化以及淀粉酶产生菌的紫外诱变育种等五个过程，并测定了诱变后菌株的16s序列，初步掌握了对某菌种进行筛选、选育及诱变的必需步骤。关键词：产淀粉酶细菌 筛选 选育 诱变育种淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平，首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良的突变菌株。淀粉酶主要来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的尤为重要。此次试验试图从土壤中分离出产淀粉酶的细菌，通过紫外线诱变育种等条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。以达到加深对菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 来源：南师大北区教学楼附近的土壤。1.1.2培养基：淀粉培养基的配制固体培养基膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.07.2。液体培养基：牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.07.2。优化条件培养基配制：淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L， K2HPO4 1.5g，MgSO47H2O 1.5g， pH 4.0 。淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L， K2HPO4 1.5g，MgSO47H2O 1.5g， pH 7.2 。碳源培养基：淀粉 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g， MgSO47H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2。葡萄糖3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO47H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2。氮源培养基: 硝酸钠10g，淀粉3g，K2HPO4 1.5g，MgSO47H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2硫酸铵 10g，淀粉3g ，K2HPO4 1.5g，MgSO47H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2。1.1.3 仪器设备：全自动高压蒸汽灭菌釜，手提式高压蒸汽灭菌釜，电子台秤，普通天平1.2 产淀粉酶细菌的分离筛选1.2.1 制备土壤稀释液：称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，振荡5min，即为稀释101的土壤悬液。然后在离心管中依次稀释至103、104 稀释度。 制备淀粉培养基平板，制5块淀粉培养基平板，倒入融化好的淀粉培养基（温度为不烫手为宜）并轻轻摇晃混匀，置于桌面冷却为平板。在无菌培养皿底部注明分离菌名、稀释度、组别、班级。 1.2.2吸取稀释液：无菌操作法分别吸取103、104 土壤稀释液0.1mL，分别加在已制好的2块淀粉平板培养基上。1.2.3涂板：用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，静置5min 划线分离：将101 土壤稀释液用接种环挑取一环，在一块淀粉培养基上进行划线分离。然后倒置于恒温箱培养。看演示培养：倒置于房间30恒温箱培养24小时。1.2.4筛选：24小时后，在之前稀释涂布和划线的3块淀粉培养基上选取典型细菌菌落（尽量选取边缘整齐和规则的菌落），并用记号笔进行编号。3块淀粉培养基上，观察是否有水解圈的产生，并测量其半径。对照备用点种平板和编号菌落的水解圈大小，挑取水解圈最大的一个菌斑，用记号笔将其勾选出来。1.2.5 分离：将编号后的菌落用无菌牙签挑取，在备用的1块淀粉培养基平板上分别点种。将点种平板继续置于30培养箱中培养。1.3 产淀粉酶菌在不同培养条件下的生长状况1.3.1 发酵液接种：提前24h将平板菌种用接种环挑取，在液体试管中打散混匀，然后按1接种量分别转接pH4 pH7.2 碳源淀粉 碳源葡萄糖 氮源硝酸钠 氮源硫酸铵 六种液体摇瓶发酵培养基。1.3.2 菌种保藏：挑取平板菌落，在斜面试管培养基上划线，30培养，然后置冰箱低温保藏。1.3.3 菌体生长量的测定：将培养24h后液体摇瓶培养物分别取出2mL于试管中，加入8mL蒸馏水，进行5倍稀释。将各稀释液分别倒入比色杯中，在721型分光光度计600nm波长下测定吸光值(optical density，OD600值)。如果菌液浓度过大，可继续稀释后再进行测量，保证OD值应控制在0.1-1之间。分别记录各种不同培养基和不同培养条件下OD600值大小，评价对菌体生长量的影响。1.3.4 不同条件对淀粉酶活性的影响测定加入试剂测定管空白管1的淀粉溶液0.1mL0.1mL 柠檬酸缓冲液0.1mL0.1mL摇匀后40恒温水浴保温5min发酵液0.2mL-蒸馏水-0.2mL摇匀后40保温15min乙酸溶液0.5mL0.5mL8000转离心5min取上清,加入1mL稀碘液试管中加蒸馏水稀释至10mL1.3.5 计算淀粉酶酶活：显色后，立即于660nm波长测定其吸光度（A）。计算各样品吸光度大小酶活力。即以1mL粗酶液在40，pH60条件下15min所分解0.1mg的淀粉质量为1个酶活力单位。（A空白管A测定管/A空白管）（1/0.215/15100.1/0.1）1.4 产淀粉酶菌种的鉴定1.4.1 产淀粉酶待检菌的培养特征与形态特征的观察与鉴定培养特征的观察:菌落光滑，较潮湿，边缘平整。细菌细胞的显微观察：细菌呈杆状，无芽孢无荚膜细菌的革兰氏染色：紫色为革兰氏阳性菌。1.4.2 细菌的16S rRNA分子鉴定用灭菌牙签挑取单菌落于PCR管中，将菌体刮蹭于管壁底部少许。反应体系：在一个PCR管中用微量移液枪加入下列物质的混合液24.5ul，置于冰上备用。 Taq buffer（10）MgCl2（25mM）dNTP（2.5 mM）Primer Forward（50 mM）Primer Reverse（50 mM） ddH2O震荡，将菌体和反应体系充分混匀 最后加入：rTaq（2U/ul）0.5ul PCR反应条件：95预变性5 min后，95变性1 min，59退火1min，72延伸1min，共25个循环，72延伸10min1.4.3 琼脂糖凝胶电泳制胶：配制0.7%琼脂糖溶液20mL，用1TAE电泳缓冲液做溶剂，加热溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待胶凝固；制样：PCR反应结束后，取出PCR管，用微量移液枪吸取5ul与1ul 6样品Buffer混合后全部点入浸于TAE电泳缓冲液中的琼脂糖凝胶的样品孔中;电泳：100V电泳20分钟；染色：将凝胶置于样品染料溴化乙锭中染色；10min，然后将凝胶置于紫外灯下进行检测，当在凝胶上出现预期大小的DNA条带（约1.5Kb），则认为是PCR阳性，这时将与此电泳样品对应的PCR反应管放置冰箱短期保存。 1.4.4 PCR扩增片段测序：获得的PCR阳性样品由专人送往测序公司进行测序，大约一周后测序结果可以返回，然后在电脑的相关软件上进行读序。1.4.5 序列比对分析：使用NCBI 网站对待测菌的16SrDNA 序列与数据库中各种菌的16SrDNA 序列进行比对。登陆 美国国立生物技术信息中心网站，使用BLASTn 在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB 基因库中进行同源性搜索。从Genebank 中选择近与待测菌目的基因序列同源性最高的已知分类的菌株的16SrRNA基因序列, 初步确定待测菌的分类位置。用Clustal软件将已知分类菌株的16SrRNA序列与待测菌的16SrRNA序列进行多序列比较。1.5 淀粉酶产生菌的紫外诱变育种1.5.1 细菌悬液制备：取液体培养物（培养了24h）1.5mL于dorf管中，每组3管，5000rpm，离心5min，弃上清；菌体用无菌水洗涤-离心两个轮次，最后每个dorf管各加1.5mL无菌水制成均匀的菌悬液。1.5.2 平板制作：融化淀粉培养基，倒4块平板，在平板上做好标识。1.5.3 紫外线处理：将紫外灯打开预热20分钟；取6cm无菌平皿一个，加入菌悬液3ml；将上述平皿置于紫外灯下的脱色摇床上，打开皿盖，距离紫外灯管 30cm，照射3min（单号排）或者6min（双号排），盖上皿盖；1.5.4 稀释菌液：在超净台内，将照射后的菌悬液用无菌水按10倍稀释法依次稀释成10-1-10-5（在dorf管中进行）；1.5.5 涂布平板：取10-3、10-4两个稀释度的菌悬液各0.1ml涂布均匀。以同样的操作，取未经紫外线处理的菌悬液稀释涂布平板作为对照。1.5.6 观察诱变结果：1. 涂布好的平板置于瓷盘中，盖上盖子，置于30避光倒置培养48小时；2 .计数：将培养好的平板取出进行细菌菌落计数；根据对照板上的CFU(colony forming unit)数,计算出每毫升 菌悬液中的CFU数，同样计算出紫外线处理后的CFU数。存活率（%）=（处理后每毫升CFU数/对照每毫升CFU数）100致死率（%）= （对照每毫升CFU数-处理后每毫升CFU数）/对照每毫升CFU数1003. 观察诱变效应：测量淀粉水解圈直径与菌落直径并计算其比值（HC比值），和对照板相比较，说明诱变效应。2 结果2.1产淀粉酶菌的筛选水解圈测定结果选取菌落与其水解圈圈比菌落编号各种菌圈12245菌落菌圈直径（mm）1.40.8水解圈直径（mm）2.0水解圈/菌圈3.12.2 不同培养条件产淀粉酶细菌的酶活培养基氮源硫酸铵氮源硝酸钠碳源葡萄糖pH=7.2碳源葡萄糖pH=4.0碳源淀粉pH=7.2碳源淀粉pH=4.0A测0.2730.4421.0060.8740.5731.058酶活力5.682-21.753-113.312-91.883-43.019-121.753由上表可知 在不同培养基下，产淀粉酶细菌的酶活力大小由小到大为：淀粉pH=4.0葡萄糖pH=7.2葡萄糖pH=4.0淀粉pH=7.2氮源硝酸钠氮源硫酸铵2.3 产淀粉酶菌的形态学鉴定分离所得产淀粉酶菌菌落外形产淀粉酶菌的革兰氏染色 培养特征的观察：菌落光滑，较潮湿粘稠，菌落边缘平整。细菌细胞的显微观察及革兰氏染色：细菌呈杆状，无荚膜无芽孢，革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌。2.4 产淀粉酶菌的分子鉴定PCR产物测序结果：登陆 美国国立生物技术信息中心网站，使用BLASTn 在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB 基因库中进行同源性搜索。测序结果为： GAAGCAGGGCGGGCGTGCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACAGAAAAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTACCCTATAGTTTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGAATAATCTCTTTTGCTTCATGGTGAAAGACTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCGCTATAGGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTTGAAGGAAACATCGGYCCAGACTCYTACSGGAKGCAGGCAGTAKGGAATCTTCCACAATGGGCGAAAGSCTTGATGGAGCAACGSCGCGTGAGTGAAGAMGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTAARGGAAGAACAAGTACAGTAGTAACTGGCTGTACCTTGACGGTACCTTATTAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCCTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAAGGAATTGACGGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCKTGACATCCCGTTGACCACTGTAKAGATATARTTTCCCCTTCSGGGGCAACGRTGACAGRTGGTGCATGGTTTGTCGYCASCTCSATGTCGTTGARATGWTRGGWTAMGTCCCTCGCAMCGAGCGGCARCCCTYGACATCTYACGTTGCTCATCCATTYAGTTGGGTACCACTCTAWCGGTGACTGCCCGSTGACAAGAGCGCATGGAGKAWGCGTGGGGCGCTATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCCGATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGATCGAG得出所测DNA序列与此种最相近，即Lysinibacillus fusiformis ZC1 contig00058，梭状菌属 。2.5 紫外诱变结果（如表格所示）淀粉酶产生菌的紫外诱变育种结果诱变条件稀释度紫外光照射前紫外光照射后10-5581610-6185致死率（%）= （对照每毫升CFU数-处理后每毫升CFU数）/对照每毫升CFU数100致死率（%）72.472.23 讨论此次实验模块，我们完整地进行了对产淀粉酶细菌的筛选与选育，在进行实验的过程中，我们发现：不同条件下，产淀粉酶细菌的酶活性不同。通过将分离获得的产淀粉酶细菌分别在不同的培养基中培养，于660nm波长测定其吸光度并计算其酶活力后，发现此类产淀粉酶细菌在pH=4.0的淀粉培养基中酶活力最高，在含氮的硫酸铵培养基中酶活力最低，可推断，产淀粉酶细菌可能适应pH为4的淀粉培养基的培养环境，而不适应在含氮的硫酸铵培养基生长。在淀粉酶产生菌的诱变育种过程，虽然经紫外光照射后，细菌菌落数有大幅度降低，有一定的致死率，但是在后续鉴定过程中，却未发现有水解圈的产生，推测问题出在接种这一步骤，未将产淀粉酶细菌接于培养基上，而是接种了其他类别的细菌