利用动物测定吸收和生物利用度.ppt

利用动物测定吸收和生物利用度 主讲人 毛磊 本章将综述体内吸收和生物利用度研究中所采取的一些重要方法以及在新药研发过程中如何应用由这些方法所获得的信息 6 1引言 6 1新药发现中的ADME PK 直到近年 人们才普遍接受在新药研发前首先进行ADME PK试验这一事实 很长一段时间以来 人们就已经深知新药研发的失败率非常之大 但是直到1988年 才有科学家发表文章指出 英国七大主要制药公司新药研发失败的很大一部分 39 是由于候选化合物的 药物动力学性质不合适 所造成 更近的一份研究报告指出 由于以上原因造成的新药失败占25 目前仍然不明确失败率的降低究竟是由于统计汇报系统的多样性造成 还是由于DMPK参与新药发现过程所致的快速改变而造成 可是 我们的经验是 一个新药研发项目的决定因素往往是多方面的 因为ADME PK已经渗入了药物的研发过程 我们就有必要重新考虑学习研究的目的 如果这项技术真的能降低研发失败率 这就有必要预测在人体中做药动学的研究可能结果 这个方法可以预报给药的剂量和给药的频率 1999年的十大药物显示它们的给药剂量都是一天一次 很明显 如果一种药物想要成为最好 并能在以后不断推出的新药中继续保持这种地位 这可能就要求这种药物的给药量是每天一次 6 1 2预测的需求 1999年的十大畅销药物 6 2关于吸收和生物利用度 有两种主要的给药方法最适合药物化学 口服给药和静脉注射口服给药非常重要是因为它对于大多数的病人服用非常方便并有很好的顺从性另一方面 从1999年全球最畅销的药物排行榜的榜单上也反映了这一点几乎所有最畅销的药物都是通过口服给药的所以 口服给药被认为是药物设计的首选给药发展方向 然而 静脉给药也是非常重要的一种给药方法 因为它能准确的测定清除率和分布容积 这两个参数是决定药物半衰期的主要参数 清除率可以改变药物在人体内的新陈代谢的速率 而改变给药的量可以通过多次给药 因此 药剂师有必要知道这两个参在人体内是如何变化的 这样他们就可以选用最优的给药方式 药物在肝门静脉中被运送到药物代谢的最主要的地方 肝脏 在肝脏中 药物往往有三个去路 参与新陈代谢 通过胆汁排泄或者返回血液中进入机体其他部位作用其他的组织也可能是药物代谢的地点 特别是肾 是药物排泄的主要地方 吸收和生物利用度的概念 吸收含义的理解常常会与生物利用度混淆 在这一章节中 药物的吸收是指将药物从给药部位的溶液中运输到静脉血液中的过程 对于口服吸收来说就是到运输到肝门静脉的过程 生物利用度是某种给药方式下获得的AUC值与以相同剂量直接给药进入人体循环所获得的AUC之比 因此生物利用度和吸收是不同的两个概念 口服生物利用度亦包括该化合物首次经过肝脏发生的代谢和胆汁排泄过程的作用 简而言之 吸收是药物传递的一个过程 而生物利用度则代表吸收量的大小 是一个具体的比值 6 3动物种类的选择 用于药动学临床前期的试验动物主要是老鼠和狗一项关于2000年和2001年的全球数据报告显示 其中的6334项的主题是有关于药物动力学的 而这之中大部分的研究是直接作用于人的 其中关于老鼠的研究占据了14 小鼠占据了7 5 狗占据了3 4 灵长类的动物也是药动学研究的重要对象 可是出于道德和伦理的限制 他们只是占据了同一时期研究对象其中的0 5 以下 以动物进行药物动力学研究的数量 大老鼠被用作药动学最初的研究对象是因为他们还被广泛用于药理学和毒理学的研究 然而 现在已经有大量的数据信息显示同种药物在老鼠和人体内药物动力学有着一定的相关性 因此 老鼠的数据可以预测人体内药动学过程 随着老鼠用于药动学的研究的重要性可能会越来越重要 老鼠作为药动学研究对象的比例也可能会逐渐增加 老鼠用于实验的出现也为药动学家提出了一项新的挑战 因为老鼠只能提供很少量的可供测量的血液 并且很难用于药物分析 然而 现在已经有公开的方法来反复从老鼠身上获得血样模型 这就意味着 一种适当的统计学上的实验设计可以被利用 这样用于实验的动物数量就可以有个限度 同样的方法可以用于大型的动物 特别是那些需要大量血样以供药代学分析而又不能在单个动物身上测定的实验 小鼠重复取血方法 1 眼眶静脉丛采血 采血时实验者的拇指和食指轻轻的压迫小鼠的颈部两侧 使眶后静脉从充血 右手持续接7号针头的1ml注射器 使之与小鼠面成45度夹角 由眼内角刺入 针头斜面先向眼球 刺入后转180度使斜面对着眼眶后界 刺入深约2 3mm 当感到阻力时立即停止推进 同时 立即将针头推出0 1 0 5mm 当穿刺适当血液能自然流入毛细管内 2 剪尾采血 需血量较少时常用此法 先将动物固定 将鼠尾浸在45 左右温水中几分钟或用酒精棉球涂擦鼠尾 使尾部血管充盈 剪去尾尖1 2mm 小鼠 使血液顺血管壁自由流入试管或用血红蛋白吸管吸取 采血结束时 伤口消毒并压迫止血 小鼠每次可取血0 1ml左右 6 4方法 在考虑怎样将数据用于预测人体ADME PK时 我们首先来讨论几种重要的分析方法 6 4 1放射性标记 放射性示踪标记法是一种可以准确测定药动学参数并能解释整个给药剂量在体内分布的方法 这种方法已经作为药动学的标准研究方法好几年了 最通用的同位素是14C和3H当然 选择准确的标记位置也是很重要的 这样它就不会在新城代谢中很容易的就遗失 例如 CH3 N和CH3 O基团 虽然使用很简单的合成方法即可实现取代 但它们却是主要的代谢部位 很容易导致重要的给药部位被转化成14CO2或者3H2O纵使可以通过计数呼出的气体 从实际的观点来说 这些标记方法都不是好的选择 人们对药动学的专家用氘来做实验总是存在偏见 这是因为这些标记物经常会使化合物的结构变成3H2O氘化水在人体内有一个非常长的半衰期 大概为六到九天 这比一般化合物或代谢物都长 不论在何种实验中 3H2O都是一种不想要的副产物 然而 我们经常发现那些有特殊标记的化合物经常丢失少量的放射性物质 例如3H2O 大部分都能通过冷冻干燥很轻易的除去 因此 就很容易获得用药剂量的大小 我们发现3H标记的化合物已经从很大程度上帮助了我们对化合物的认知 以及它的化学序列 也能给出药物代谢的主要路径以及吸收的范围 这就让体外实验数据变得更具可靠性 6 4 2 1静位方法 最简单的离体含量测定方法包括在一只麻醉的小鼠的体内分离出一段胃肠道 同时要尽可能的保持血液和神经系统的支持 因此 这一段要持续接受血液的支持 任何被吸收的药物都能被代谢转运出去 药物的成分通过血液被吸收进入这一段 在实验的最后 我们就收集这离体的一段来研究残留在这里的药物 测定损失的没被吸收的部分以此来估算吸收量的大小 通过将药物在不同的时间注射进入不同的部位 这样就能建立损失量与时间关系曲线 这种方法具有简单的优点 可是由于所用的生物基质很难分析 很难获得较好的回收率 对于吸收度差的药物 经常需要准确的测定他们的吸收度 由于吸收量很小 待吸收量接近100 从而使准确估计非常困难 6 4 2 2灌流法 正是由于以上各种原因 灌流法就被发展起来了 已经有报告 通过在老鼠原位单遍灌流的方法已经能成功的预测在人体内的吸收度在这个模型里 动物要被麻醉 并且要暴露出肠道的一段还要插套管 药物的成分通过胃肠段灌注进去并分别测定前后的浓度 这个方法的优点是可以用于多次测定灌注液的若干个成分 并且可以从一个清洁的生物样品中测量 然而 由于这种模型必须经历显著的手术改造过程 所以用于离体灌注的胃肠段有时候不是那么精准的预测在整个动物体内的吸收结果 所以在整个动物体内的吸收模型就明显有优势多了 6 4 3体内方法 有很多可能的方法可以测定一个药物经口服给药后的吸收可能最简单和最直接的方法是放射性标记法 对于绝大部分的研究 这就意味着14C或3H标记这个方法其实很简单 将已经标记了的药物喂给一个被养在一个独立代谢笼子里的动物 然后收集它的全部的小便和大便用于分析 排泄物的收集一直要收集到足够测量到放射性元素就可以了然后它们将用于放射性物质的研究 最简单的 我们能这样假设 经过口服的吸收 至少在小便中检测出的放射性元素都是已经被吸收代谢了的 这就给出了一个药物的最小吸收度 如果将粪便和研究对象都做色谱分析 这样可以使实验结果更准确 但是 若母体药物被吸收后从胆管中未经转化就排出 此方法就可能产生误导作用了 另一种改进方法可以避免必须寻找合适的粪样提取和色谱分析方法的过程 就是在两个单独试验中分别静注和口服给予放射性标记的化合物 由定义可知 静脉注射给药的所有剂量嗾使生无可利用的 通过比较两种不同的给药途径下尿中排泄的剂量就可以估算出吸收的量了 6 5 1同时多重给药方法 同时多重给药方法是第一批使得ADME PK研究得以高通量进行的方法之一 它能减少实验动物的数量并且增加同一时间药物的测定量 这个方法在同一时间给实验动物服用几种不同的药物 现在所用的高效液相色谱和质谱分析方法的选择性和灵敏度 可以在几个化合物同时存在的情况下分别测定它们的含量 尽管现在已经有报告称这种方法最多可以同时测定二十二种不同的化合物 但是通常都是将数量限制在三种到六种 这种方法有很大的好处 相对于相同的血液样本 实验动物只需给药一次就可以测定 这就比每次测一个化合物就须给药一次方便多了 然而 给药的剂量必须有一定限制 以便减少实验动物的压力和可能的药物之间的相互作用 6 5 2半 同时给药 定量给药法是一种可以减少差异性和加速试验结果的方法 实验中 每间隔一小段时间 常常是4 6小时 一般小于48小时 通过对关注的两种不同给药途径对动物给药 根据常规的方法收集血样 用于母体药物的研究分析 随后建立药时曲线 如果有必要的话 可以除去在第二次给药后仍然存在的第一次给药后的药物 这种方法的优点是降低了两种给药途径下对药物动力学结果产生的变异 由此对两种给药途径下获得的药物动力学参数对比性就更可靠了 而且该实验所取血液量也不多 可以减少受试验动物的负担同时消除了再次试验过程 关于这种方法的最初的提案 最早是被门特卡洛提出的 并且已经通过临床前期和临床的研究给证实了 这种实验方法是很稳定和精准的 并且不是高度依赖于数据的模型 这种方法在两种情况下对吸收和生物利用度的评估较差 1 当化合物为非线性药代动力学特征的 这种情况常常在血浆蛋白结合为非线性特征的或者当化合物为心血管活性 能够以浓度依赖方式改变血流时发生 2 当吸收速率非常低 而由此导致 翻转式 动力学 即表观的终末半衰期是根据药物的吸收速率决定的 6 6吸入给药 对于人体给药或者临床前安全性研究中所使用的动物类型来说 有很多给药的方法 但由于篇幅有限 我们这里就不一一详述 然而 吸入给药途径是一种值得我们思考的重要方法 这种给药方法非常适用于哮喘症或者是慢性梗阻性肺部疾病 或者当大分子肽或蛋白类这类药物既不能穿过胃肠道又不能被胃肠道吸收的生物大分子制剂 如果这些药物在体循环的转运过程中肺部给药有事一个合适的给药的途径的情况下 吸入给药方法就显得更为重要了 这些药物分子的吸收过程被认为是通过气管扩散及在肺中肺泡部位发生扩散和胞饮作用发生的 即使是在肺部存在着轻度的代谢活性 通过直接给药进入靶点位置都是很好的作用方法 同时也能限制全身性的副作用 但是 在研发阶段进行吸入试验几乎是不可能的 而且它需要很复杂的给药系统 同时 会带来显著的口腔服药 其可能的原因是直接咽下了气雾剂或动物在吸入给药结束后将其毛皮上的颗粒拭入口中 6 7 1用于预测吸收的模型 如果需要测量吸收分数 可以通过体外研究方法 就像书上其他章节描述的 例如像caco 2细胞 所测得的表观通透率与人体内吸收的百分数之间的相关性曲线经常有很大的斜率 因此 一个很小因素的改变 可能被测定的化合物就从很小的人体吸收度变成了很好的吸收度了 其他的模型系统 如基于ussing尤斯池消化道组织的模型 都在很大程度上依赖于高质量的组织样品的供给 由于这样一些原因 体内模型较体外模型有着显著的优势 尽管吸收速率会有很大的不同 但是各物种间的吸收度确是相似的 例如人和大鼠吸收百分率之比非常接近于1 其相关系数为0 97 6 8 1体型变异测定法 体型变异测定法被认为是一种最流行的用于测定人体内药代动力学的研究方法 这种技术最初是用于解释动物体型和器官重量之间的关系 这种方法是基于找出生理学和药物代谢动力学之间参数的相互关系 一般来说 关系式如下 其中y是因变量 例如清除率 B是自变量 例如体重 脑容量或者最高寿命 而a和x分别为体型变异测定法的系数和指数项 体形变异测定法中的系数和指数主要是以经验为主决定的 一般认为和生理学特征没有任何关系 这种方法的缺点就是基本依靠经验 而且对于不同物种之间不同的清除率考虑不周 它是基于代谢清除率和血流量是成正比例的 最近就有关于体型变异测定法展开了一场争论 这就表明在体型变异测定法能可靠地大量应用之前仍需进一步的大量工作 有人指出我们不可能预先就发现体型变异测定法的不合理性 而且事实上该法的预测准确度也不想设想中的那样