超声造影在肝脏疾病的应用_14285

超声造影在肝脏疾病的应用 【摘要】 超声造影使超声医学发生革命性的进展，真正达到了非创性和高效性目的。文章从声学造影剂的作用原理、发展过程、相关的新型造影技术及其在肝脏疾病的应用临床研究方面作了综述。 【关键词】 肝脏疾病 超声造影 1 声学造影剂的作用原理及其发展过程 1.1 声学造影剂的作用原理 声学造影剂 (contrast agents)，也称为回声增强剂 (echo-enhancing agents)，是由空气或其它气体微泡组成，外包裹不同的膜物质作为外壳或吸附于微颗粒物质，此外还含有溶液介质的溶剂如注射用水、生理盐水、磷酸缓冲液等及改进造影剂物理化学性能的增稠剂、稳泡剂、抗氧化剂等辅助成分。其作用原理为：这些微气泡是超声波的强的散射体，可以使背向散射信号提高 30dB，提高普通灰阶超声和多普勒超声对富含微气泡组织的探测。微气泡在声场交变电声压作用下的非线性运动产生谐波信号，以谐波散射回声成像， 能提高声束的轴向分辨率及回声的信躁比，改善图像质量 1， 2。 1.2 声学造影剂的发展 声学造影剂早在 1968年开始应用于临床，主要用于心血管造影3。 1989年声振人体白蛋白造影剂 Albunex 的生产，开创了经末梢静脉注入造影剂到达肝脏的造影新途径 2， 1994年首次应用于肝脏临床研究 4。 声学造影剂按其发展阶段分为两代 2， 4：第一代为空气微泡造影剂，主要为白蛋白、多糖等包裹的空气微泡，以 Albunex和Levovist（ SHU 508A 利声显）为代表， 直径一般为 2 m8 m，可通过肺循环，但在血液中存留时间仍较短。第二代声学造影剂（即新型声学造影剂）为含氟碳气体的微泡造影剂，例如 Echogen、 Sonovue、 AF系列、 Nc 100100等，这些微泡中因含惰性气体，在血液中溶解度较低，所以存留时间较长 ,可以产生更稳定而持久的声学效果。同时国内的“全氟显”与“脂氟显”在动物实验中并在小范围内进行临床试用也获得较好的效果 5。 2 新兴的超声造影显像技术 微气泡声学造影剂具有较强的散射作用，可以增强实质性脏器的灰阶显像和多普勒信号 强度。但由于造影剂浓度偏低，在血液中的半衰期短，散射回声强度低等原因，需要采用一些增强造影剂散射回声的技术，目前已有的新技术主要有以下几种 2， 4。 二次谐波灰阶成像 (second harmonic gray imaging， SHGI): 由于造影剂的非线性运动产生较强的谐波信号，可以敏感地检测微小血管中微气泡的存在，此外还减少了近场伪像及旁瓣伪像。 能量多普勒谐波成像 (power doppler harmonic imaging，PDHI)：造影剂的应用，使血流信号得到增强，提高能量 多普勒显像对微小血管内低速血流的检出能力，但常有伪像及由于血流信号过度增强引起的花怒放伪像（ blooming artifact） 6。 间歇式谐波成像 (intermittent harmonic imaging， IHI)：又称间隔延迟谐波成像 (interval-delay harmonic imaging， IDHI)，这一技术将触发显像与谐波显像相结合。基本原理是较高能量（通常以机械指数 MI表示）的超声波呈间歇式发射。此技术可敏感探测到毛细血管内低速血流，反映微循环血流状况，提供了组织血流灌注的 重要信息。 脉冲反向谐波成像（ pulse inversion harmonic imaging，PIHI）：也称为编码脉冲反向谐波成像（ coded pulse inversion harmonic imaging），即脉冲反向谐波成像与编码技术 7， 8，又称为编码谐波血管显像（ coded harmonic angio， CHA） 9。探头连续发射两组相位相反的声波，返回后，基波由于时相相反而抵消，而非线性部分的谐波则得到加强，从而更敏感地检测微细血管内的低速血流。 3 正常肝脏的超 声造影 造影剂经末梢静脉注入后，经右心、肺循环、左心、主动脉，而后由两个途径进入肝脏：一是由腹腔动脉到肝动脉，二是经门静脉进入肝血窦。采用实时成像技术可以观察肝组织增强的动态过程。其大致可以分为三个时相： 肝动脉相：表现为肝实质内动脉血管迅速显影，呈亮线状强回声，血管分支形态规则，似“枯树状”，随着造影剂进入微小血管及肝窦（相当于肝脏微循环），肝实质回声亦逐渐增强。门静脉相：表现为门静脉主干及其一、二级分支内充盈造影剂，血管呈“条带”状较强回声。由于门静脉血流量占肝血供的 2/3，此时肝实质增强 较显著。延迟相：表现为肝组织呈均匀强烈增强，在造影剂注入后 3分钟左右达到高峰，此时血管结构不显影。关于延迟相肝实质增强的原因，目前国内外大多数学者都认为可能是造影剂在循环过程中，被正常肝脏的网状内皮系统（ Kupffer 细胞）吞噬或滞留于窦状间隙内或黏附于血管壁，触发成像时，这些微气泡产生强烈的谐波信号，使肝实质回声增强。 超声造影对肝脏疾病诊断的依据就是根据血管显像期病变组织与正常肝组织动态变化的差异及延迟相两者不同的增强类型。 4 超声造影在肝脏疾病中的应用 4.1 肝占位性病变的鉴别诊断 资料表明 7， 10， 11，超声造影在肝脏应用最多是鉴别肝内占位性病变，且有很大的应用价值。不同的肿瘤具有不同的病理特征，从而在造影超声中形成不同的增强类型。以下为肝内几种常见肿瘤性病变的造影增强方式。 笔者对 248 例肝占位性病变患者应用新型超声造影剂 Sonovue行实时双模式灰阶成像超声造影检查。其中原发性肝癌 122 例，转移性肝癌 26例，肝血管瘤 68例，肝局灶性结节性增生 32例。病变均经手术或超声引导下穿刺活检病理证实。结果 248例病灶均表现不同程度的增强 。 90.2（ 110/122）原发性肝癌在动脉相显著增强，门脉相快速消退， 75.4（ 92/122）病灶在早期延迟相呈明显低于肝实质的低回声结节或团块； 9.8（ 12/122）病灶在整个造影过程中始终表现为低回声团块。 68例肝血管瘤平均 31.4s开始增强， 61.7（ 42/68）病灶早期呈典型的边缘边框样和块状增强，随后增强呈向心性逐渐充填，增强可持续整个门脉相和大部分延迟相，明显长于肝脏恶性病变。肝局灶性结节性增生平均 17.7s开始增强， 75.0（ 24/32）动脉相可见自中心向外周增强的车辐状血管影，增 强的持续时间也明显长于肝脏恶性病变。 73.1（ 19/26）转移性肝癌早期动脉相明显增强，门脉相开始减退，至延迟相回声明显低于正常肝组织， 26.9（ 7/26）增强不显著。资料显示不同性质肝占位性病变在超声造影中形成不同的增强方式，见表 1，从而为肝肿瘤的诊断和鉴别诊断提供依据。超声造影双幅模式灰阶成像技术能准确定位，使病灶造影剂充盈的时相尤其是早期动脉相显示更清晰准确，也使病灶的造影增强过程由于双实时图像对照而显示更清晰，有较好的临床应用前景。有报道表明超声造影对肝占位的诊断效果与螺旋 CT增强造影一致。 4.1.1 原发性肝癌 在动态扫描中，动脉相瘤体多显著增强，并可见不规则、分支状增强的血管伸入瘤体内，敏感度为 82.9%，特异度为 93.8%8，增强可持续至门静脉相，在延迟相，大多数肿瘤呈增强缺损区或部分性增强10， 11。 Jang HJ 等 13对 51个肝癌病灶行造影 CHA检查，动脉相69%（ 35/51）瘤内可见不规则血管增强影，延迟相早期 71%（ 30/51）病灶呈不均匀增强，延迟相后期全部瘤体呈现造影缺损区。大多数肝癌的血供较丰富，且以动脉供血为主，供血动脉扩张、迂曲，肿瘤周 围及中心有异常增生的血管及动静脉吻合支，故在显像中呈“快进快出”的特点， Wang等 12， 13在研究中也发现肝恶性肿瘤增强的持续时间显著短于其它良性病变。另外，肿瘤组织内网状内皮系统已被破坏且肿瘤中心易发生缺血性坏死，所以延迟相造影剂在瘤内分布很少，与周围增强的正常肝组织相比容易形成造影增强的缺损区 14。 4.1.1.1 原发性肝癌超声造影表现与生物学特性关系 现代的超声造影通过动态观察造影剂对组织的强化过程，有效反映病变组织的血流动力学变化 15，绝大多数的原发性肝细胞癌（ HCC）超声造影呈“快进快退”的典型表现 16， 17，但临床上常出现一些 HCC呈不典型的“快进慢退”或“少进”或呈造影剂充盈缺损等表现，甚至一些患者彩色多普勒超声呈多血供情况，但造影仍呈不典型的“快进慢退”表现，笔者设想与其生物学特性有关，而流式细胞仪（ FCM） DNA分析方法可反映肿瘤细胞的生物学特性 18，为此笔者19通过对比观察 HCC造影表现的典型组与不典型组以及肝内局灶性结节性增生（ focal nodular hyperplasia， FNH）等 34例的 FCM DNA 分析。结果显示 26例 HCC超 声造影后呈典型 “快进快退”表现者 18例，呈不典型表现 8例； 8例 FNH造影均呈“快进慢退”的非典型表现。结果显示超声造影呈典型表现组的 DNA 表现为高增值的 S期与G2/M期比值均显著高于不典型组与 FNH组（均 P0.05），但值得强调的是 3例彩色多普勒超声未检出的瘤栓经超声造影检查，有 2例被检出。本研究结果表明实时超声造影检查可提高门静脉瘤栓的检出率。 4.1.1.4 实时双幅灰阶超声造影在肝细胞癌与胆管细胞癌鉴别诊断中的价值 原发性肝癌病理分为肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)，胆管细胞癌 (cholangiocellular carcinoma， CCC)与混合细胞癌。近年来，胆管细胞癌有上升趋势，由于临床对 HCC与胆管细胞癌的治疗方法与预后均不相同，准 确诊断胆管细胞癌对指导临床治疗有重要意义。常规二维灰阶超声与彩色多普勒超声对胆管细胞癌的诊断价值已有报道 2628。笔者 29通过临床与病理确诊为原发性肝细胞癌 20 例与胆管细胞癌 12例在实时超声造影中的对比观察。结果显示 HCC组 20例全部呈典型的“快进快退” 型超声造影表现。胆管细胞癌组 5例表现为早期动脉相呈边框样或中间少许增强，并迅速消退，呈“少进快退”型；另 7例在整个造影过程中病灶均未见强化，呈“造影剂充盈缺损”型。尤其值得提出的是， 1例肝左叶胆管细胞癌肝内广泛转移，普通灰阶超声仅见肝内回声不均或 境界模糊的斑点状回声，彩色多普勒超声亦未能显示异常血流信号，造影后见肝内布满境界清楚的圆形低回声小结节，整个造影过程呈“造影剂充盈缺损”型。本研究表明实时双幅灰阶超声造影能为肝胆管细胞癌提供更多的诊断信息，弥补普通灰阶超声与彩色多普勒超声的不足，并且能更准确地了解病变的范围与转移与否，有较好的临床应用价值。 4.1.1.5 双实时灰阶超声造影对复发性肝癌的诊断价值 复发性肝癌多合并肝硬化以及手术或 (和 )反复的插管介入等治疗造成肝内解剖与病理的改变影响彩色血流的显示，使彩色多普勒超声的 诊断准确性明显下降。超声造影技术的发展，能实时观察组织的动态强化过程，有效反映病变的血流动力学变化，使肿瘤的定性诊断成为可能 3032。笔者 33应用超声造影技术观察复发性肝癌与肝血管瘤、肝局灶性结节性增生等 82例肝肿瘤的造影增强过程。结果显示复发性肝癌多表现为快速消退型，如以快速消退型作为复发性肝癌的诊断指标，则超声造影诊断复发性肝癌的灵敏度、特异度及准确性分别为93.5%(43/46)、 100%(36/36)和 96.3%（ 79/82），与肝血管瘤的自周围向中心结节样快速或缓慢充填，并呈持续增强型明 显不同，同样与肝局灶性结节性增生多表现为动脉相快速自中心向外周放射状的持续增强也明显不同。 4.1.2 肝血管瘤 大多数以门静脉供血为主，内部多为血流缓慢的血窦。超声造影，增强后，动脉相瘤体边缘可呈结节样增强，随后增强呈向心性逐渐充填，敏感度为 83.3%, 特异度为 100%8，边缘也可呈边框状增强或无增强，增强可持续至整个门静脉相和延迟相，呈“慢进慢出”的特点。 Bartolotta TV 等 34对 28例在普通超声下呈非典型表现的血管瘤（ 79%为不均匀性高回声， 18%为均匀低回声 ， 3%为等回声）行Levovist 造影增强 PIHI成像，其中 57%病灶在动脉相呈周边结节样增强，在门静脉相及延迟相呈进行性向心性完全或不完全性增强； 14%病灶动脉相呈快速完全性均匀增强，并持续整个门静脉相和延迟相； 29%病灶动脉相呈边框样增强，门静脉相及延迟相进行性充填。边缘结节样增强为血管瘤的特异性征象，但敏感性较低。 4.1.3 肝内局灶性结节性增生（ FNH） 病理特征是由中央动脉及其放射状分支供血。大多数 FNH在动脉期呈弥漫增强，并可见迂曲的营养动脉及车辐状血管影，延迟相与肝实质增强程度相近或强于肝实质，敏感度为 83%，特异度为 98%35，增强类型呈“快进慢出”型。 Marcus J等 35研究显示，动脉相60%(6/10) FNH为血供丰富的病灶，其中 3 个病灶 (50%)内可见卫星状的血管影；在延迟相， 4个病灶与肝实质回声相当， 6个病灶高于肝实质回声，其中 5个病灶内可见未增强的疤痕样条索影。 肝内局灶性结节性增生（ FNH）是较常见的肝内良性肿瘤 36，常规二维与彩色多普勒超声的诊断率均较低 37，临床上多以增强 CT或 /和 MRI作为重要诊断方法。新近的超声造影技 术根据造影剂微泡于动脉期呈轮辐状快速增强与延迟期持续增强的特殊表现，使 FNH的诊断率高达 80%以上 16，但笔者发现脂肪肝背景可能对 FNH超声造影征象产生影响，因此对比观察合并脂肪肝与正常肝脏计 23例 FNH的超声造影。结果显示有脂肪肝的 A组结节呈低回声与偏低回声占 84.6%（ 11/13），无明显脂肪肝的 B组结节呈高回声与偏高回声占60%(6/10)， A、 B两组的回声呈明显差异（ P0.05）。超声造影检查： A组结节内于动脉相早期呈中心轮辐状增强 8例、偏心增强 5例，延迟期呈低回声 3例，超声造影诊断符合率为 76.9%(10/13)， B组结节呈动脉早期中心轮辐状快速增强 7例、偏心快速增强 3例，延迟期100%呈持续性增强，超声造影诊断符合率为 100%。 资料表明 FNH 合并脂肪肝时二维超声可呈低回声改变，超声造影于延迟期可呈低回声的消退改变，如结节较小，尤其 2cm的结节，早期动脉期多未能清晰呈典型的轮辐样快速增强表现，此时超声造影也难以诊断 FNH，则常需 行穿刺活检加以鉴别。 4.1.4 转移性肝癌 血供的多少取决于原发癌的病理特征。造影时，动脉相外周可呈点状、边框状增强，敏感度为 83.8%，特异度为 76.4%7，在门静脉相及延迟相几乎不增强。 Hohmann J等 11的研究显示，动脉相 91%（ 20/22）转移瘤周边呈点状增强，延迟成像早期周边可见边框状，条状增强，在延迟相中全部为充盈缺损区。 4.2 提高对肝内肿块的探测率 与普通超声相比，造影超声在肝内能检出更多、更小肿块，提高肿块清晰度，尤其是对近膈面的病灶，造影谐波超声明显优于普通超声 38。 Quaia E等 13利用 Levovist及 PIHI成像方法，在造影延迟相检测肝内转移瘤，并与普通超声及螺旋 CT 相对照，评价指标为肿块的清晰度，检出肿块的数目及最小肿瘤的大小。结果显示，用超声造影PIHI成像技术检出的肿块数目最多，其清晰度明显高于普通超声，与螺旋 CT相比，能检出更多可疑性病灶，经术中超声活检或随访 36 个月，病灶均被确诊，三种检查方式所显示的最小肿瘤平均直径分别 为3mm、 7mm、 5mm。另外，对肝硬化病人的监测中，超声造影对小肝癌及隐匿性肝癌的发现早于 MR39。在与肝硬化结节的鉴别诊断中有潜在价值 40。 4.3 评价肝肿瘤介入治疗效果 肝脏恶性肿瘤的介入治疗疗效，一方面依赖于瘤体的组织灭活，另一方面有赖于肿瘤血流的阻碍程度，后者则决定着肝癌介入的中远期疗效，如果治疗后瘤内仍存在血流，意味着治疗不彻底或复发。造影超声能敏感地检测出内部残存的血流信号，对肝癌的局部治疗疗效能较早做出正确的判断，以便决定进一步相关的治疗。 Minami Y8在动脉插管化疗碘油栓塞治疗肝癌的疗效评价中发现，治疗 1周后，造影PIHI、动态 CT及动态 MR对病灶内血流信号的发现率分别为 86%、43%、 50%，对 19例只行动脉插管的患者行造影 PIHI检查，其中 17 个病灶内发现血流信号，在随后的动态 CT随访中均显示肿瘤复发。Morimoto M等 41应用 CHI成像评价肝动脉插管栓塞治疗肝癌的疗效，并与组织学检查结果比较，治疗后 7天， 55%(16/29)病灶中仍可见血流信号，经组织学检查 16个病灶中 13个仍可见残留癌组织，超声造影 CHI成像对其疗效评价的灵敏度和特异 度分别为 100%和 80%。 目前，超声引导下无水乙醇消融 (percutaneous ethanol injection， PEI)已成为治疗肝细胞癌（ HCC）重要的非手术方法 42，43。笔者 42， 44根据肝癌生长的时间和空间病理特点提出“量化”消融治疗方法，使疗效明显提高，尤其使肿瘤直径 3cm肝细胞癌的 5年生存率达到 60以上。消融后肿瘤结节呈不同声像改变，彩色多普勒超声检查对疗效评价尚有某些局限。以往多以增强 CT作为疗效判断的主要依据，超声造影能够明确消融彻底与否以及消融范围，可作为各种 消融治疗疗效判断的可靠方法 45， 46。为此，笔者 47从二维超声、彩色多普勒超声及超声造影 3个方面分析 54个肿瘤结节乙醇消融治疗后不同时间的声像图改变，探讨超声造影对乙醇消融量化治疗肝细胞癌的疗效判断及其在随访中的价值。经超声引导无水乙醇消融量化治疗肝癌 54例，分别于 1个月、 12个月、 24 个月超声造影复查。结果显示 54个消融结节中 2个肿瘤结节于治疗结束时可见小片区域轻微增强，病理活检见残留肝癌细胞， 1个结节于 1个月复查时周边见局部轻微增强，病理活检见肝癌细胞，其余 51个消融结节于 1个月、 12个月、 24个月超声造影均未见增强表现，穿刺活检亦未见癌细胞，其中高回声结节病理表现以纤维瘢痕组织为主，低回声结节以坏死组织为主。资料显示，肝细胞癌在乙醇消融量化治疗后可产生多种声像图改变，给传统的超声影像学诊断带来困难，超声造影与传统影像学方法相结合可以更好地评价乙醇消融疗效，判断随访过程中是否复发，有重要的临床应用价值。 4.4 超声造影与流速剖面技术评价肝硬化程度 近年来随着超声造影技术的不断发展，应用超声造影反映组织脏器血流灌注情况已成为可能，而肝硬化的病理改变使其血流动力学发生明显变化 。因此国内外学者开始尝试应用超声造影观察肝血流动力学变化以评价肝硬化的程度 48， 49。彩色多普勒流速剖面 (CDVP) 技术是最近开发成功的一项新的检测技术，能直接测量血管截面瞬时的流速空间分布以及血流量 50。笔者应用实时双幅模式超声造影对比观察不同病程肝硬化患者 23例门静脉右支开始显影时间以及流速剖面技术检测的门静脉右支流速和血流量 , 并分析两者之间的相关性，以探讨其评价肝硬化程度的临床意义。结果显示肝硬化组门脉右支开始显影时间25.7 1.61s较非肝硬化对照组的 21.38 0.59s明显延长（ P0.01），平均流速、最高流速以及血流量较非肝硬化对照组明显降低（ P0.01）。肝硬化失代偿组门脉右支开始显影时间长达 29.583.44s较肝硬化代偿组的 23.2 0.51s明显延长（ P0.05），其平均流速、最高流速以及血流量较肝硬化代偿组明显降低（均为 P0.01）。肝硬化患者门脉右支开始显影时间与门脉右支平均流速、最高流速以及血流量之间均存在明显负相关（ P0.01， P 0.05与 P0.05）。资料表明随着肝硬化程度的加重，门脉右支开始显影时间逐渐延长，流速和血流量逐渐下降，两者之间呈明显负 相关性，能较好地反映肝硬化代偿期和失代偿期门脉血流动力学变化情况，对于评价肝硬化程度具有较高的临床价值。 4.5 肝脏霉菌感染超声造影表现的初步探讨 笔者为探讨肝脏霉菌感染的超声特点，分析 5例肝脏霉菌感染的彩色多普勒超声与超声造影表现，并与超声引导下穿刺活检病理相对照。 5例肝脏霉菌感染彩色多普勒超声检查显示：结节内部均未探及明显血流信号。超声造影示：动脉相、门静脉相、延迟相结节内均未见增强，整个造影过程呈“充填缺损”表现，仅 2例在动脉相早期可见结节周边少许增强。资料表明肝脏霉菌感染多 表现为大小不等的低回声结节，少数结节可呈类似转移性肝癌特征性的“牛眼征”表现。“充填缺损” 的超声造影表现对诊断有一定帮助。超声引导下穿刺活检行病理检查可确诊肝脏霉菌感染。 5 超声造影技术应用新进展 5.1 超声造影技术在疾病靶向显影方面的应用 人们在超声造影技术研究的过程中发现，如果将造影剂与一些细胞特异性的配体结合，再利用配体与靶细胞的特异结合将造影剂募集至特定组织器官，就可实现器官或组织的特异性显影。国外许多学者在这一方面进行了有益的尝试，也取得了可喜的成绩。 Bian AN等 51将抗人肝癌细胞单克隆抗体 HAb18吸附于脂质小体的表面，制成具有肝癌细胞特异性的靶向超声造影剂。他们认为细胞特异性超声造影剂能够特异性地提高肝癌诊断率，尤其是早期肝癌的诊断率，且较为安全。 5.2 超声造影剂在疾病治疗方面的应用 Unger EC等 52曾报道，他们自制了一种可作为超声造影剂的含有紫杉醇的磷脂微泡 -MRX-552，并且利用实验证明 MRX-552具有良好声学特性，可用于超声对比增强造影，并且在超声波的作用之下可以崩解，从而释放出紫杉醇。在小鼠体内进行的急性毒性实验也证明 MRX-552毒性远低于游离的紫杉醇。上述结果证明此种具有声学特性的脂类微泡作为化疗药物的载体是一种可行的方法，其制备简单，使用方便。 Lawrie A等 53认为在心血管疾病的基因治疗发展的进程中最大的障碍来自于病毒载体的安全性、实用性的怀疑，他们 结合自己以前的研究结果认为，超声造影剂在超声波作用下可以明显地提高血管内皮细胞的 DNA质粒转染，并且明显提高转基因在内皮细胞的表达，因此可以作为一种安全、高效的基因载体，应用在心血管疾病基因治疗当中。 5.3 超声造影剂在基因工程中的应用 Greenleaf WJ 等 54报道通过加入超声造影剂 Albunex并在一定能量超声作用下，可使人软骨细胞的绿色荧光蛋白基因转染率比以前的提高 34倍。 5.4 展 望 超声造影技术以其简便、无创、安全等优点，在短时间 内就被广泛应用于多个领域。但是，我们也应该看到，现在的超声造影除了在常规疾病诊断这一方面已在临床大规模开展之外，其他的应用多数还停留在实验室研究或动物实验阶段，对其应用效果的估计只是基于动物实验结果或是实验室数据，因此其对于人类的适用性、安全性尚需进一步的临床实验来证实。因此，超声造影技术的进一步应用，还需大量更加深入的研究工作。 【参考文献】 1 Schuessler G, Ignee A, Hirche T, et al. 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