活性污泥及生物膜生物相观察.doc

环境微生物学第9章9.5 活性污泥及生物膜生物相观察9.5.1 活性污泥或生物膜微生物的显微镜观察及微型动物的计数9.5.1.1 目的和原理 活性污泥和生物膜是生物法处理废水的主体，污泥中微生物的生长、繁殖、代谢活动以及微生物之间的演替情况往往直接反映了处理状况。因此，我们在操作管理中除了利用物理、化学的手段来测定活性污泥的性质，还可借助于显微镜观察微生物的状况来判断废水处理的运行状况，以便及早发现异常状况，及时采取适当的对策，保证稳定运行，提高处理效果。为了监测微型动物演替变化状况还需要定时进行计数。9.5.1.2 材料与器皿（1）显微镜、载玻片、盖玻片、微型动物计数板、目镜测微尺、台镜测微尺。（2）活性污泥（或生物膜）样品。9.5.1.3 方法与步骤（1）压片标本的制备取活性污泥曝气池混合液一小滴，放在洁净的载玻片中央（如混合液中污泥较少可待其沉淀后，取沉淀的活性污泥一小滴加到载玻片上，如混合液中污泥较多，则应稀释后进行观察）。盖上盖玻片，即制成活性污泥压片标本。在加盖玻片时，要先使盖玻片的一边接触水滴，然后轻轻加下，否则易形成气泡，影响观察。在制作生物膜标本时，可用摄子从填料上刮取一小块生物膜，用蒸馏水稀释，制成菌液，以下步骤与活性污泥标本的制备方法相同。（2）显微镜观察低倍镜观察 观察生物相的全貌，要注意污泥絮粒的大小，污泥结构的松紧程度，菌胶团和丝状菌的比例及其生长状况，并加以记录和作出必要的描述。观察微型动物的种类、活动状况，对主要种类进行计数。 污泥絮粒大小对污泥初始沉降速率影响较大，絮粒大的污泥沉降快。污泥絮粒大小按平均直径可分成三等：大粒污泥；絮粒平均直径500m，中粒污泥：絮粒平均直径在150500m之间，细小污泥：絮粒平均直径150m。污泥絮粒性状是指污泥絮粒的形状、结构、紧密度及污泥中丝状菌的数量。镜检时可把近似圆形的絮粒称为圆形絮粒，与圆形截然不同的称为不规则形状絮粒。絮粒中网状空隙与絮粒外面悬液相连的称为开放结构；无开放空隙的称为封闭结构。絮粒中菌胶团细菌排列致密，絮粒边缘与外部悬液界限清晰的称为紧密的絮粒；边缘界线不清的称为疏松的絮粒。实践证明，圆形、封闭、紧密的絮粒相互间易于凝聚，浓缩，沉降性能良好，反之则沉降性能差。活性污泥中丝状细菌数量是影响污泥沉降性能最重要的因素，当污泥中丝状菌占优势时，可以从絮粒中向外伸展，阻碍了絮粒间的凝聚，使污泥SV值和SVI值升高，造成活性污泥膨胀。根据活性污泥中丝状菌与菌胶团细菌的比例，可将丝状菌分成五个等级：0级：污泥中几乎无丝状菌存在；级：污泥中存在少量丝状菌；级：存在中等数量的丝状菌，总量少于菌胶团细菌；级：存在大量丝状菌，总量与菌胶团细菌大致相等；级；污泥絮粒以丝状菌为骨架，数量超过菌胶团细菌而占优势。高倍镜观察 用高倍镜观察，可进一步看清微型动物的结构特征，观察时注意微型动物的外形和内部结构，例如钟虫体内是否存在食物胞，纤毛环的摆动情况等。观察菌胶团时，应注意胶质的厚薄和色泽，新生菌胶团出现的比例。观察丝状菌时，注意菌体内是否有类脂物质和硫粒积累，以及丝状菌生长，丝体内细胞的排列，形态和运动特征，以便判断丝状菌的种类，并进行记录。油镜观察 鉴别丝状菌的种类时，需要使用油镜。这时可将活性污泥样品先制成涂片后再染色，应注意观察丝状菌是否存在假分支和衣鞘，菌体在衣鞘内的空缺情况，菌体内有无贮藏物质的积累以及贮藏物质的种类，还可借助鉴别染色观察其对该染色的反应，具体方法与步骤可参见本书丝状微生物的鉴别。（3）微型动物的计数取活性污泥曝气池混合液盛于烧杯内，用玻棒轻轻搅匀，如混合液较浓，可稀释一倍后观察。取洁净滴管（滴管每滴水的体积应预先测定，一般可选用一滴水的体积为120ml的滴管），吸取搅匀的混合液，加一滴（1/20 ml）到计数板中央的方格内，然后加上一块洁净的大号盖玻片，使其四周正好搁在计数板四周凸起的边框上（如图51）。图51 微型动物计数板用低倍镜进行计数。注意所滴加的液体不一定要求布满整个100个小方格。计数时只要把充有污泥混合液的小方格挨着次序依次计数即可。观察时同时注意各种微型动物的活动能力、状态等。若是群体，则需将群体上的个体分别逐个计数。计算 假定在被稀释一倍的一滴样品水样中测得钟虫50只，则每毫升活性污泥混合液中含钟虫数应为：50只202=2000只4结果与分析将观察结果填入下表（表51），选择与结果相符者打“”表示：表51 活性污泥镜检记录絮体大小大，中，小，平均m絮体形态圆形；不规则形絮体结构开放；封闭絮体紧密度紧密；疏松丝状菌数量0；游离细菌几乎不见；少；多微型动物优势种(数量及形态)其他种(种类、数量及状态)9.5.2 活性污泥中丝状微生物的鉴别9.5.2.1 目的和原理 丝状微生物是一大类菌体细胞相连且形成丝状的微生物的统称，其包括丝状细菌、丝状真菌、丝状藻类（蓝细菌）等。丝状微生物，特别是丝状细菌之所以引起人们的高度重视，是由于它们同菌胶团细菌一起，构成了活性污泥絮体的主要成分，并具有很强的氧化分解有机物的能力，当它们超过菌胶团细菌而占优势生长时，由于它的比表面积大，会影响絮体的沉降性能，造成污泥膨胀，以致严重影响处理效果。 Eikelboom（1975，1981）对丝状微生物的鉴别做了大量工作，他从产生膨胀的活性污泥中采取数千个样品，按照以下几个方面，将活性污泥中的丝状微生物区分成29个类型，其中大多为丝状细菌。是否存在衣鞘；滑行运动；真分支或假分支；丝状体的长短、形状和性质；细胞的直径、长短和形状；革兰氏染色反应；纳氏染色反应；有无内含物（PHB、硫粒和异染粒等）。本试验依照Eikelboom的方法对活性污泥中的丝状微生物作一鉴别。9.5.2.2 材料和器皿（1）显微镜、载玻片、盖玻片、目微尺、台微尺，（2）染色液：革兰氏染液、纳氏染液；（3）Na2S溶液、酒精溶液。9.5.2.3 方法与步骤（1）形状特征观察 借助显微镜，观察丝状微生物的长度、直径、分支的有无、横隔和运动状态等。长度、直径：用目微尺度量。分支：某些丝状微生物的丝体有时有分支，分支有真假之分，细胞是分支的，称真分支。有鞘细胞可产生假分支，它的游离细胞若附着在鞘上，可生长成新的丝体。有时稍有损伤，外侧形成开口，开口附近的细胞则进一步生长而形成分支，这即为假分支。运动性：只有少数滑行细菌能作蛇样的滑行运动，其游离于污泥絮粒之间。内含物：某些丝状细菌细胞内可含有贮藏物质，因折光性与细胞中其它部分不同，很易察见，常见的有聚-羟基丁酸（PHB）及硫粒。两者的区别是：滴加酒精后硫粒溶于酒精，而PHB依然完整。横隔：相邻两个细胞间的壁。丝体的形状：一般分下列三种，笔直丝体（在丝体较长时亦可略有弯曲）；弯曲丝体以及扭曲成卷曲的丝体。附着生长物：丝状菌表面通常很“光滑”，如在丝体表面附有细菌或小絮体，称为“附着生长物”。缩缢：某些具有连续外壁的丝状菌在横隔处因外壁收缩而形成的凹缢。细胞的形状：可区分成球状、杆状、圆盘状或椭圆状。有时丝体外壁无缩缢，这类细胞也可称为方形或长方形细胞。鞘：为具鞘的丝状细胞体外圆柱形的管状结构，染色片中往往可明显的看到鞘。（2）染色技术不同的丝状微生物对某些特定的染色反应各不相同，据此我们可很容易的将它们区分开来。 革兰氏染色这是鉴别细菌的一个重要方法。步骤如下：a. 制备涂片；b. 染色：将经固定后的涂片用草酸铵结晶紫染液染1分钟，水冲，使干；c. 媒染：用碘液媒染1分钟，水冲，使干；d. 脱色：连续滴加95乙醇使其脱色，直至滴下的乙醇无色为止（约0.5到1分钟），水冲，使干；e. 复染：用藏花红复染1分钟，水洗，使干；f. 镜检：用高倍镜及油镜观察染色结果，革兰氏阳性（G+）呈紫色；革兰氏阴性（G-）呈红色。 纳氏染色g. 制备涂片；h. 取二份纳氏染色A液，一份纳氏染色B液相混，染色1015秒，水冲，使干；i. 取纳氏染色C液染色15秒；j. 水冲，干燥后镜检。纳氏染色阴性的丝状菌菌体呈浅棕色至微黄色，阳性菌丝状体内含有深色颗粒或整个丝状体完全染成蓝灰色。 积硫试验某些丝状菌能将还原性硫化物转化成元素硫并在细胞中以硫粒形式贮存。步骤：取少量活性污泥与等体积Na2S溶液混合，放置15分钟，不是摇动，使污泥保持悬浮。制成压片标本，镜检细胞中是否有黑色的硫粒。（3）查检索表将活性污泥样品经上述步骤观察后，记录其特征，查检索表（表52），即可将其分别归类。6 9.5.2.4 结果与分析（1）将活性污泥样品中不同丝状微生物的特征记录于表53；表53 丝状微生物特征观察记录表观察项目特征丝状微生物编号备注123456分支不分支假分支真分支滑行运动是（+）；否（-硫粒可见（+）；无（-）横隔可见（+）；不可见（-）丝状体形态笔直；弯曲；盘旋状或螺旋状纳氏染色颗粒或细胞蓝灰色（阳性，+）浅棕色至微黄色（阴性，-）革兰氏染色阳性，（+）；阴性（-）丝状体直径2.2微米附着生长物有(+)；没有或很少(-)细胞相接处下陷可见（+）无（-）细胞形态盘状球形或椭圆形杆形正方形长方形衣鞘有（+）；无（-）表54 丝状微生物鉴定结果丝状微生物编号种名优势种优势种中等偶见123456注：特征观察多项选择的以“”表示，两项选择的以“+”或“-”表示。（2）查检索表52，将种名填入表54，并注明它们在活性污泥中的优势度；（3）比较不同工业废水处理系统中的丝状微生物种类和数量的差别。9.5.2.5 试剂配制（1）纳氏染色液 A液： 亚甲基蓝 0.1克 冰醋酸 5毫升 酒精（95%） 5毫升 蒸馏水 1000毫升 B液： 结晶紫（取0.33克结晶紫溶于3.3毫升96的酒精中） 3.3克 酒精（96） 5毫升 蒸馏水 100毫升 C液：1%碱性菊橙水溶液（chrysoidin Y，2,4-二氨基偶氮苯） 33.3毫升蒸馏水 66.7毫升（2）Na2S溶液Na2S。7H2