转基因小鼠的鉴定.doc

转基因小鼠的鉴定一， 剪鼠尾 1,剪鼠尾的时间 当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。2,分辨小鼠的年龄 a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生； b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生23天； c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生34天； d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右； e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右； f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。3,剪鼠尾后对小鼠的标记 一般在小鼠的耳朵或指甲上做标记，如果在用剪指甲来标记的话，时间过长则不易分辨。所以一般还是选择用左右耳朵上剪的刀数来标记，正常情况下一笼小鼠不会超过10只，依次标记为左1刀，右1刀，左2刀，右2刀，左1右1刀，左2右1刀，左1右2刀，左2右2刀，左3刀，最后一只不剪耳。二， 从鼠尾中提取DNA1,剪0.5cm的鼠尾，放入1.5ml的EP管中。2,加入500lSNET,其中蛋白酶K浓度是400l/ml。 注：SNET鼠尾裂解液配方（100ml）：200mM的Tris-Cl 取1M的Tris-Cl（PH8.0）2ml 5mM的EDTA 取0.5M的EDTA（PH8.0）1ml 400mM的NaCl 取2.34g 1%（m/v）SDS 取10ml 10%SDS 加水定容至100ml 临用时加蛋白酶K400g/ml，即100ml的SNET加40mg。3,放入55 0C孵育过夜（最好放入摇床55 0C振荡过夜，也可放入55 0C烘箱过夜，第2天摇床55 0C振荡23个小时）。4，消化好后，每只EP管内加入14l 6M NaCl溶液，涡轮振荡仪上剧烈振荡30s-1min。5,12000rpm离心10min，取上清400l 到另一1.5mlEP管内。 注：a离心时EP管对称放置且最好开口处靠近轴部； b取“另一1.5mlEP管”时，选择盖子内部正常无多余部分，以免第6步的絮状沉淀挂在多余部分。6,向每只EP管内加入2倍体积的无水乙醇800 l ，轻轻翻转几次混匀，可见絮状DNA沉淀（若看不见沉淀可在-200C冰箱中过夜促进沉淀）。7,12000rpm离心10min，弃上清，注意不要把沉淀倒出，再滤纸上抽尽残余液体。8,加入1ml 70的乙醇，将沉淀摇起。9, 12000rpm离心10min，弃上清，再滤纸上抽尽残余液体。10, 待乙醇完全挥发后，向每管中加入含RNase的TE 50l，在涡轮振荡仪上振荡片刻（以免EP管壁上的沉淀未被含RNase的TE浸没），37 0C左右的烘箱中溶解12小时。 注：含RNase的TE是RNase与TE的比例为1:1000 溶DNA的TE的配方（PH8.0）：100mmol/L的Tris-Cl（PH8.0） 10mmol/L的EDTA（PH8.0） 分装后在15psi（1.05kg/cm2）的高压下蒸汽灭菌20min，RT保存.11,溶解好后，放入微波炉中低火微波20s，再放入超声仪中超声20s，接着水浴940C水浴20min以除去多余的蛋白酶K，最后放入-200C冰箱保存。三， PCR目前实验室的转基因小鼠AD,CNGA2,THY1,GFP,OMP-Cre体系可以用同一个体系。PCR反应的体系（20l）：10Buffer缓冲液（含2价镁离子） 2ldNTP 1l25pmol/l上下游引物 0.5/0.5lEasy Taq酶 0.1lDMSO 1l水 14.4lDNA 0.5l注：刚买回的上下游引物是干粉，需加入适量TE（加入TE的量与管外侧的标记有关）溶解，这样可以贮存较长时间，要用时需用水稀释引物，引物与水的比例为1:3，这样上下游引物的浓度就是25pmol/l先在1.5ml的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中（一般多加两小管的量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次（尽量避免产生气泡）以便Taq酶混合均匀，最后再在各PCR管中依次加入DNA样品。品系：AD 两对引物APP（P1/P2）和PS1（P3/P4），APP为300bp左右，PS1为600bp左右，APP与PS1连锁，因此应该对应一致，程序为Main-LTLUO. CNGA2 两对引物R+（F引物/R+）和R-（F引物/R-），R+与R-位于X染色体上，R+为300bp，R-为250bp，只有R+则说明是野生型，只有R-则说明为阳性，既有R+也有R-则说明为杂合子，若R+与 R-都没有则说明DNA没提好或PCR失败,程序为Main-CNG. THY1 一对引物thy1/chr2，700bp左右，程序为103-CHR2. GFP 两对引物wild（M71A/M71B）和EgFP（M71B/EGFP）,wild为350bp，EgFP为250bp，只有wild则说明为野生型，只有EgFP则说明为阳性，若二者都有则说明为杂合子，程序为PENG-OMPCR. OMP-cre 一对引物cre-Jdsense/OMP-FRT，200bp左右，程序为PENG-OMPCR。 如果一次想做多种品系的PCR，可以将各个品系的体系分别做好后，一起用程序PENG-OMPCR做PCR也可行。 四， 电泳 1,配胶：鉴定用的胶板有大、中、小3种，分别用的梳子为50、25、11齿,分别用的0.5*TBE的量为90ml、45ml、25ml。 5*TBE贮存液/500ml的配制：27g Tris，13.75g的硼酸，100ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0) 鉴定以上介绍的品系均可用1.5%的琼脂糖凝胶。 例如，配一块50孔的胶，需取9ml 5*TBE稀释10倍到90ml，再加入1.35g的琼脂糖，微波加热至其完全溶解，冷却片刻，滴入少量EB（轻微振荡均匀后溶液呈现较浅的红色），将均匀的溶液慢慢倒入已插好梳子的胶板中（注意不要产生气泡），冷却10min左右即可。 2,点样：在PCR后的DNA产物加入loading buffer以对DNA进行沉淀和染色，20l的DNA中加入2l的10*loading buffer或4l 的6*loading buffer。 点样时注意逐个点样，不要点错，最好把中间的那个孔留着点Marker，这样可避免点样的出错。Marker的选择依基因片段大小而定。Marker标记条带的大小Marker1（100、200、300、400、500、600）bpMarker11（100、300、500、700、900、1200）bpMarker111（200、500、800、1200、2000、3000、4500）