生技整理考试重点.doc

说明：1、资料中未按名词解释、简答等的次序排版，如有需要，大家自行解决。2、有些细节，大家自己去看课件补充吧3、愿大家顺利。一、基因工程本章总体思路1、生物技术：包括基因工程、细胞工程 、发酵工程 、酶工程 、蛋白质工程 2、基因工程：在体外对DNA进行切割、拼接, 使遗传物质重新组合, 经载体转移到细胞中扩增表达, 获得人类所需产品, 或组建新生物类型的技术。3、基因工程诞生的理论基础：DNA是遗传物质；DNA双螺旋结构；中心法则和遗传密码4、基因工程诞生的技术突破：DNA分子的体外切割与连接技术 DNA分子的核酸序列分析技术5、基因工程元年：1973年6、基因工程的特征：1. 跨物种性：外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖 2、无性扩增：外源DNA在寄主细胞内可大量扩增和高水平表达。 1.1 工具酶7、工具酶：（以下为常用工具酶）工 具 酶功 能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3末端反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析（含义：以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶）多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3羟基末端进行同质多聚物加尾（1、探针标记2、在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接）碱性磷酸酶切除末端磷酸基（制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接）8、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)：是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列, 并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH基团和5-磷酸基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。 分类: 包括限制性核酸内切酶、（基因工程技术中常用型） 作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。9、平末端 (blunt end): DNA的两条链在同一位置被切开，产生末端长度相等的DNA片段，即平末端。 粘末端(sticky end)：DNA分子的两条链在不同的位置（中间隔2-4核苷酸）被切开，形成一条交错的伤口，所得的DNA片段在末端都具有短的悬垂部分，即粘末端。10、同裂酶：来源不同的限制性内切酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同裂酶。同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。11、DNA连接酶的连接方式：1、粘性末端连接 2、平端连接 3. 末端修饰后进行连接 4. 人工接头连接 1.2 载体(vector)12、载体：是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接，实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的DNA分子13、理想载体的基本条件： 1、可转移性2、具有安全性3、合适的复制位点4、多克隆位点：广泛、特异5、选择标志，便于筛选和鉴定6、分子较小，可容纳较大的外源DNA14、质粒：存在于细菌染色体外的小型共价闭合环状DNA分子。 要求：含有复制起点；含有多克隆位点（MCS）；含有筛选标记； 高拷贝数；分子量小；易于导入宿主细胞15、T-克隆载体：5端带一个不配对的碱基T，这样的线性质粒可将PCR产物以TA配对连接的方式直接进行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的载体被称为T-克隆载体 U-克隆载体：5端带一个不配对的碱基U的线性质粒称为U-克隆载体16、噬菌体克隆载体优点： 其分子遗传学背景十分清楚； 载体容量较大，能容纳大约23kb的外源DNA片段； 具有较高的感染效率，其感染宿主细胞的效率几乎可达100% 。 噬菌体分类;(1) 插入型载体（insert vector）：其限制酶位点可用于外源DNA的插入 (2) 取代型载体（replacement vector）：具有成对限制酶位点，外源DNA可取代两个限制位点上的DNA区段。重组DNA与包装蛋白混合，可在体外包装成有感染力的重组噬菌体颗粒噬菌体应用：包装范围:36.4Kb-51.5kb 转导效率:lg重组DNA分子获得10 个以上的噬菌斑.用途:建立cDNA基因文库,克隆外源目的基因。 17、酵母人工染色体(YAC) 把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母的转录功能和复制功能。 特点: 能容纳长达 1000kb-3000kb的外源DNA片段用途: 构建基因组文库，基因治疗和基因功能鉴定。 18、表达载体（expressing vector） 表达载体是用来在受体细胞中表达外源基因的载体。表达载体常由克隆载体改造而来。 1.3 目的基因20、目的基因的获取方法：（1）酶切法（限制性内切核酸酶酶切） ；（2）化学合成法（由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列） ；（3）cDNA文库、基因组DNA文库；（4）聚合酶链式反应（PCR）21、PCR引物设计原则：（1) 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-30 bp为宜。 (3) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm4(G+C)+2(A+T)；（4）碱基尽可能随机分布。（5）引物内部避免形成二级结构。（6）两引物间避免有互补序列。（7）引物3端为关键碱基；5端无严格限制22、PCR反应中的主要成份 1. 引物 2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) 3. Mg2+ 4. 模板 5. Taq DNA聚合酶 6. 反应缓冲液 23、基因组DNA文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合24、cDNA文库 将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群。25、基因的定位诱变 利用合成DNA和重组DNA技术，使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。用到的主要技术： 寡核苷酸指导的定位诱变 盒式诱变(cassette mutagenesis) PCR定位诱变 1.4 重组体的导入和鉴定26、作为理想宿主的基本要求 能高效吸收外源DNA分子不具有限制修饰系统应为重组缺陷型菌株根据载体类型选择相应宿主根据载体标记选择合适宿主具有安全性 27、常用的宿主细胞 1、大 肠 杆 菌： E.coli表达体系优势： （1）一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 （2）繁殖迅速，培养代谢易于控制 （3） 易于进行遗传操作和高效表达 2、 酵 母：优势：基因结构相对比较简单，便于基因工程操作；培养简单，适于大规模发酵生产，成本低廉；外源基因表达产物能分泌到培养基中，便于产物的提取和加工；不产生毒素，是安全的受体细胞。 3、哺乳类动物细胞 哺乳动物细胞表达系统的缺点是，对组织细胞培养技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长。 4、植物细胞28、外源DNA导入宿主细胞方法 外源DNA导入原核细胞外源DNA导入真核细胞转化转染感染酵母细胞哺乳动物细胞植物细胞CaCl2包装蜗牛酶形成原生质体微量注射法电穿孔法磷酸钙共沉淀法原生质体融合法精子介导法微量注射法电穿孔法农杆菌转化基因枪法花粉管法植物转基因常用方法： 1、.载体介导转移系统 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(root-indcingplasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。2、基因枪轰击法 将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达 3 花粉管通道法 在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。 1.5、目的克隆的筛选与鉴定29、目的克隆的筛选 （1）抗生素抗性选择法（2）插入失活法 （3）-半乳糖苷酶显色反应法（蓝白筛选）30、目的基因序列鉴定 （1）菌落原位杂交：是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。（2）限制性酶图谱分析（酶切后，进行PCR，看是否有目的条带） （3） DNA序列检测（桑格 双脱氧终止法）31、分子杂交技术Western blot（抗原抗体杂交） 原理及步骤：经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分 Southern 杂交 DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为 DNA ，探针为 DNA 或RNA步骤：Northern 杂交 RNA 片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为 RNA，探针为 DNA 或 RNA步骤：二、氨基酸和蛋白质1、氨基酸等电点：在某一定PH溶液中，氨基酸所带的正电荷和负电荷相等时的PH.2、蛋白质来源：重组 人工合成天然蛋白：产量少、成本高；不易分离纯化；易受病原侵染重组蛋白：高表达量、成本低；高纯度；安全。 获得重组蛋白的一般方法：（1）离体细胞中表达；（2）转基因植物或动物中表达 获得重组蛋白的步骤：（1）分离目的基因 （2）目的基因连接到表达载体 （3）表达载体导入受体细胞 （4）通过发酵培养细胞 （5）分离、纯化目的蛋白 （6）得到目的蛋白3、细菌表达系统的优缺点： 优点：1、繁殖速度快 2、蛋白质产量高 3、易培养，花费少 4、仪器成本低 缺点：1、无法表达分子量大的蛋白质（50KD） 2、无法去除糖基或信号肽 3、真核生物的蛋白质对细菌可能有毒害作用 4、无法很好处理富含2S键蛋白质的S-S4、酵母表达系统的优点： 优点如上所述（第27题）+ （1）能表达分子量大的蛋白质（50KD） （2）能去除糖基或信号肽 （3）有伴侣蛋白能协助一些蛋白质的折叠 （4）能很好处理富含2S键蛋白质的S-S5、病毒表达系统的优缺点： 缺点：（1）生长缓慢 （2）寄主细胞的培养只能持续4-5天 （3）表达系统的构建比较费时，不如酵母简单 优点：（1）能表达分子量大的蛋白质（50KD） （2）修正糖基和去除信号肽 （3）有伴侣蛋白能协助一些蛋白质的折叠 （4）产量非常高，成本低。 三、蛋白质的分离内容概要：一、Disruption of cells（细胞裂解）:Osmotic（渗透作用）Enzymatic（酶法）Mechanical（机械压力法）二、Clarification（澄清）: Centrifugation（离心）Filtration（过滤）三、Concentration（浓缩）: Precipitation(沉淀 凝聚)Ultra filtration（超滤）1、蛋白质提纯的方法及原理 （一）盐析 原理：蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后（主要用硫酸铵），由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。（二）柱层析法 分类 按层析的机理划分： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。 原理 离子交换层析 离子交换基团在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同的交换常数，K值愈高，被吸附愈牢。洗脱时，增加溶液的离子强度，如改变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。洗脱过程中，按K值不同，分成不同的区带。 凝胶层析 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了亲和层析 亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。疏水作用层析 蛋白质表面一般有疏水与亲水基团，疏水作用层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其蛋白质疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质 基本原理如图所示： L+HSLHS+WP：固相支持物L：疏水性配体S：蛋白质或多肽等生物大分子H：疏水补丁W：溶液中水分子P没有活性蛋白的提纯方法（三）电泳 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度决定于蛋白质分子的大小，SDS是一种去垢剂，可以与蛋白质分子相结合，使其变性并带上大量的负电荷，同时变成棒状，从而掩盖了蛋白质原有电荷和形状的差异。蛋白质分子的迁移率与蛋白质相对分子质量的对数成直线关系。根据样品的迁移率不同，可以将不同中蛋白质分开。SDS的作用：SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，其所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 2、活力单位：在最适条件（25）下，每分钟内催化1微摩尔（mol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位 酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。 酶的比活力代表酶制剂的纯度。指每毫克蛋白所含的酶活力单位数。对于同一种酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。 3：HPLC,即高压液相色谱法，是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。FPLC全称为快速蛋白液相色谱，其原理与高效液相色谱理论类似，是由经典的液体柱层析引入气相色谱理论，并且对相体进行了改革，配用高压输液泵，采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等发展起来的现代液相色谱. 四、蛋白质结构解析1、蛋白质结构鉴定的方法及其优缺点： （一）X射线晶体衍射图谱法 晶体X射线衍射是X射线在蛋白质晶体中发生的衍射现象。当X射线入射到晶体分子上时，晶体上的每个原子使射线发生散射，散射的波之间相互叠加发生衍射，衍射的结果随蛋白质晶体结构的不同而有所不同，并以此来确定蛋白质的结构步骤：1、提纯蛋白质 2、经过柱层析分离蛋白质 3、电泳 4、悬滴法使蛋白质结晶 5、X射线照射晶体，根据衍射图谱分析蛋白质三维结构。优点：分辨率高； 缺点：蛋白质结晶难（X射线晶体衍射要求蛋白质处于晶体状态）；难以测定膜蛋白结构；要求蛋白质纯度高。（二）核磁共振 处于某个静磁场中的自旋核系统在收到一定频率的射频磁场作用时，共振吸收某一射频频率辐射，电子由基态跃迁激发态，再由激发态回到基态时，就会释放出射频，被检测器检测而成像，根据成像确定蛋白质的结构步骤：1、13C和/或15N标记蛋白质 2、在水溶液中浓缩蛋白质 3、将样品置于一定的外界磁场中，13C和15N原子核会发生自旋产生的磁场与外界磁场相