分子遗传标记在中药中的应用ppt课件.ppt

DNA分子遗传标记在中药中的应用 1 DNA分子遗传标记 广义的分子标记 molecularmarker 是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质 常用的是狭义的分子标记概念 即DNA分子标记 DNA分子标记主要分为以下三类一 限制性片段长度多态性 RFLP 是发展最早的分子标记技术 以分子杂交为核心技术 二 DNA序列测定 2 三 基于PCR的分子标记 根据引物的选择可分为随机引物扩增和特定序列位点扩增 随机扩增多态性DNA RandomamplifiedpolymorphicDNA RAPD 随机引物扩增PCR ArbitraryPrimer PCR AP PCR 3 2 DNA扩增产物指纹分析 DNAamplificationfingerprinting DAF 与RAPD技术不同的是引物浓度更高 长度更短 5 8个bp 只有2个温度循环 在RAPD中是3个温度循环 一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳 3 特征扩增区段测序 Sequence characterizedamplifiedregions SCAR 先做RAPD分析 然后克隆目标RAPD片段进行测序 根据RAPD片段两末端的序列设计特定引物 一般比RAPD引物长 24bp 再进行PCR扩增 可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来 可重复性高 4 RFLP技术及其应用 RFLP RestrictionFragmentLengthPolymorphism 限制性内切酶切片段长度多态性 是70年代发展起来的DNA片段分析技术 该技术不仅在生物学 医学 农学的许多领域都有了成功的应用 而且在中药材品种基源及其地理品系 栽培品系的质量评价方面也有许多应用 5 基本原理 生物在进化过程中 由于种种原因引起基因突变和DNA分子结构重排 造成了分子内核苷酸排列顺序的改变 当这种改变涉及到限制性酶切位点时 酶切后产生的DNA片段长度将发生变化 限制性片段的长度在不同个体间呈多态性现象 即称为限制性片段长度多态 RestrictionFragmentLengthPolymorphism 简称RFLP 6 RestrictionFragmentLengthPolymorphism RFLP EnzymescutDNAatspecificsequencesRestrictionsitesareoftenpalindromes 6 cutterGAATTC4 cutterTCGACTTAAGAGCT 7 8 DNA多态性根据其产生的两种基本方式 碱基对突变类型 基因点突变 即限制性内切酶识别位点上发生了单个碱基替换 转换或颠换 使原有切点消失或产生新的切点 结构重排型 这是由DNA内部发生较大的顺序变化所引起的 9 10 RFLP与镰状细胞贫血 11 基本实验步骤 靶DNA的准备核酸探针的标记杂交显示 12 RFLP的优点及局限性 优点 1 普遍存在 2 稳定性 3 共显性 4 探针与限制酶的组合数量无限局限性 1 用RFLP仅能检测出影响到限制性内切酶识别位点的突变 2 步骤多 工作量大 而且接触的放射性污染也多 3 RFLP分析技术要求DNA无显著降解 因此只适用于新鲜的材料 难适用于干燥药材的鉴别 4 限制性内切酶价格较贵 13 RFLP用于亲缘关系分析 Ladder 14 RFLP在中药材鉴别中的应用 一 近缘种的鉴别如 海马的PCR RFLP分析 二 药用植物亲缘关系的研究如 羽扇豆属植物系统发育关系及与生物碱分布的关系 15 RAPD技术及其应用 RAPD RandomAmplifiedPolymorphicDNA 随机扩增多态性DNA 技术是1990年由杜邦公司Williams和Welsh两个研究小组同时发展起来的一项DNA多态检测技术 该技术高效 灵敏 简便 快速 一经出现就被普遍用于物种种属分类 亲缘关系分析 物种起源鉴定 目的基因筛选 农作物育种等研究领域 近年 RAPD技术又进入了中药材的鉴别研究领域 并得到广泛应用 已成为目前用于中药材鉴定报道最多的分子遗传标记技术 16 RAPD技术基本原理 RAPD的核心技术是PCR反应 但又不同于经典的PCR 它是以任意序列的寡核苷酸为引物进行PCR扩增 Williams称之为RAPD 引物通常为10个碱基 Welsh称之为AP PCR ArbitraryPrimerPCR 引物为20 30个碱基 对于任一引物 如在一定范围内模板DNA上有与之互补的反向重复序列时 就可扩增出此范围的DNA片段 17 RAPD randomlyamplifiedpolymorphicDNA 18 基本实验步骤 模板DNA的制备PCR扩增 通常RAPD扩增条件为 93 预变性200s 开始如下循环 94 变性lmin 36 退火1min 72 延伸2min 经过40个循环后 72 延伸5min 循环结束后反应产物置于4 保存 扩增产物20 l反应产物走凝胶电泳 经溴化乙锭染色检测扩增的情况RAPD图谱的数据处理 19 RAPD分析的优越性和不足 优越性 1 无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序 也无需专门设计RAPD扩增反应的引物 引物随机合成或是任意选定的 长度一般为9 10个寡核苷酸 2 扩增没有特异性 3 退火温度较低 一般为36 这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对 同时也允许了适当的错误配对 以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性 4 简便易行 省力省时 5 检测灵敏方便 6 所需样品DNA量极少 仅为10ng 为RFLP的1 l000 l 2000 7 能自动化 20 不足 1 重复性不高 RAPD在扩增反应时使用的是低温复性 通常为36 特异性不高 引物与模板间有较高的错配率 结果容易受到多种因素的影响 不同的实验室这间有时不能重复 2 对模板DNA质量要求高 操作要求严格 检验成本相对较高 3 由于存在共迁移 分子量相同的片段可能不是同源的 另外一条带中可能含有不同的扩增产物 4 RAPD标记难以区分开杂合子和纯合子基因型 不能有效的鉴定出杂合子 21 M12345678910111213141516 不同Mg2 和dNTP浓度对RAPD带型的影响 22 123456789101112M 不同Taq和Primer浓度对RAPD带型的影响 23 M12345678910111213 M13141516171819202122232425 不同循环量和模板DNA浓度对RAPD带型的影响 24 M123456CK789101112 不同复性温度对RAPD带型的影响 25 图4不同复性温度对RAPD带型的影响Fig4EffectonRAPDprofilesindifferentannealingtemperature M123456CK789101112 不同复性温度对RAPD带型的影响 26 RAPD分析在中药研究中的应用 道地药材的评价例 当归药材道地性的RAPD分析野生与栽培种及不同农家品种亲缘关系分析例 人参及山参RAPD指纹动物药的鉴定例 蛇类药材分子遗传标记鉴别的研究 27 AFLP技术及其应用 扩增酶切片段多态性 AmplifiedRestrictionFragmentPolymorphism 是一种基于PCR的DNA指纹技术 AFLP是近几年来继RFLP RAPD之后发展最快的DNA分子标记技术 被誉为新一代的分子标记技术 近年来已得到广泛的应用 28 AFLP基本原理 AFLP的基本原理是对基因组DNA限制性酶切片段进行选择性扩增 先将基因组DNA用限制性酶消化 产生粘性末端 然后使用人工合成的双链接头 artificialadapter 与基因组DNA的酶切片段相连接形成扩增反应的模板 接头和与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点 AFLP反应的结果是主要扩增那些由上述两种酶共同酶切的片段 29 基本实验步骤 模板的制备 即DNA酶切及人工接头的连接 RestrictionoftheDNAandligationofoligonucleotideadapters 限制性片段的选择性扩增 Selectiveamplificationofsetsofrestrictionfragments 扩增产物凝胶电泳分析 Gelanalysisoftheamplifiedfragments 30 AFLP的实验过程 31 AFLP反应流程 AFLP反应程序主要包括模板DNA制备 酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤 各步骤具体的过程有 首先要制备高分子量 HMW 基因组DNA 选择6个碱基识别位点的限制性内切酶 通常是EcoRI或PstI或SacI 酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接 形成带有接头的特异性片段 DNA片段的预扩增 在Taq聚合酶的作用下 完成AFLP的选择性扩增 PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳 多态性比较分析 特异片段回收克隆分析 32 为什么用双酶解 适合PCR扩增的效率与变性胶的分辨率减少PCR扩增的片段 从而减少使用选择性碱基的数目使标记单链成为可能增加PCR扩增的灵活性增加使用引物的灵活性 33 为什么要预扩增 减少选择性碱基的错配降低背景噪音 34 35 AFLPs 36 37 38 荧光标记全自动AFLP ForABI377DNASequencerandAFLPKits 39 AFLP技术特点 扩增效率高 多态性比例高AFLP标记稳定可靠 不受基因组来源和复杂度的影响 没有种属特异性AFLP技术较简便易行 不需要Southern杂交 不需要预先知道DNA的顺序信息 对模板浓度的变化不敏感 允许一定程度的共扩增 且只需要极少量的DNA材料AFLP是一项专利技术 受专利权保护 其分析试剂盒价格偏高 40 AFLP的重复性问题 Jonesetal 1997 同一实验在欧洲的8个实验室重复 172条带只有1条在一次实验中没有 重复率99 4 与SSR的水平相当 Jones C J etal 1997 ReproducibilitytestingofRAPD AFLPandSSRmarkersinplantsbyanetworkofEuropeanlaboratories Mol Breed 3 381 390 41 AFLP在分子中药中的应用 AFLP技术可产生丰富而稳定的遗传标记 它可以用于药用植物遗传分析的各个方面 如分类 系统发育 品种鉴别 遗传图谱构建及目的基因的定位等例 AFLP法构建人参 西洋参基因组DNA指纹图谱 42 微卫星标记分析 SSR 微卫星中重复单位的数目存在高度变异 这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同 因而造成多个位点的多态性 如果能够将这些变异揭示出来 就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性 SSR标记又称为sequencetaggedmicrosatellitesite 简写为STMS 是目前最常用的微卫星标记之一 由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列 因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆 测序 然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增 从而将单个微卫星位点扩增出来 由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异 个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性 这一多态性称为简单序列重复长度多态性 SSLP 每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因 由于SSR重复数目变化很大 所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性 43 SSR位点标记的优点 约50 呈多态性共显性数目多且在基因组中均匀分布多数位点呈选择中性 符合群体遗传学了理论技术上适合用PCR分析半自动化 结果可靠部分降解的DNA样品也可用适合于等位酶变异小的居群水平的研究 44 SSR位点标记的缺点 可用的位点数目少设计引物的费用高 耗时长物种专一性在说明群体分化和物种分化时可能产生错误 45 SSR标记的应用领域 遗传图谱的构建连锁分析特殊的基因 如感病基因 姻亲分析样品鉴定 如父本分析 血缘分析 等号样品分析 杂种分析 物种和居群的遗传多样性群体遗传学分析 如有效群体大小 群体遗传结构 群体分化 迁移与基因流动 传粉生物学与散布生物学 如花粉和种子的散布 交配系统 保护生物学 46 Comparisonamonggeneticmarkers 47 由微卫星衍生的微卫星标记 微卫星引物PCR MP PCR 也叫单引物扩增RCP singleamplificationPCR 简写为SPAR 该方法是利用单个微卫星的人工合成寡核苷酸片段为引物进行PCR扩增 可以想象 如果两个反向排列的微卫星出现于同一可扩增的范围内 这两个反向排列的微卫星间的序列就可扩增出来 因而该方法称为微卫星引物PCR 用此方法扩增出来的是两个反向排列的微卫星之间的序列 并非微卫星位点本身 实践证明 用该方法对三核苷酸 四核苷酸 五核苷酸重复的微卫星位点的扩增效果较好 而对二核苷酸位点重复的扩增效果较差 48 ISSR Inter simplesequencerepeat 这是Zietkiewitcz等 1994 发展起来的又一种微卫星基础上的分子标记 与SSR标记相反 该法是直接利用同位素标记的SSR序列为引物 用PCR的方法扩增两个SSR之间的单拷贝序列 为增加特异性 设计引物时在引物的5 端和3 端分别引入1 2个选择性碱基 引物长度16 18bp 扩增产物通过放射自显影显现 这样其扩增物就是MP PCR扩增产物中的一部分 提高了实验结果的可重复性 ISSR引物的开发不象SSR引物一样需测序获得SSR两测的单拷贝序列 开发费用降低 与SSR标记相比 ISSR引物可以在不同的物种间通用 不象SSR标记一样具有较强的种特异性 与RAPD和RFLP相比 ISSR揭示的多态性较高 可获得几倍于RAPD的信息量 精确度几乎可与RFLP相媲美 检测非常方便 因而是一种非常有发展前途的分子标记 已用于遗传作图 品种鉴定等研究 49 DNA测序技术及其应用 DNA测序原理及方法优点及不足优点 DNA测序技术重现性好 结果准确清楚 而且可以利用已测物种的DNA序列建立