植物组织培养.doc

植物组织培养研究性学习报告目的：掌握基本原理掌握基本概念了解开展组织培养工作的基本设施掌握植物组织培养基本的操作技术掌握植物组织培养在植物快繁、脱毒等方面的应用。内容：(1) 掌握组织培养的概念和类型；(2) 掌握组织培养的特点；(3) 了解组织培养发展史；(4) 初步掌握组织培养在农业实践上的应用。 植物组织培养是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（或试管培养。器官：根、茎、叶、花、果实、种子组织：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等植物组织培养特点：培养条件可以人为控制生长周期短，繁殖率高管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养的理论基础细胞全能性细胞全能性：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力植物细胞全能性的表达：一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化和再分化。脱分化：将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化再分化:经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。植物组织培养过程：离体的植物器官、组织、细胞-脱分化-愈伤组织-再分化-根芽-再生植株植物的生活史：受精卵-早期胚胎发育-合子胚-分化-组织-形成-器官-构成-植物体植物组织培养过程：外植体-脱分化-愈伤组织-再分化-组织-形成-器官-构成-植物体胚性细胞：保持着未分化状态和旺盛的分裂能力的一类细胞，这类细胞彼此相似、细胞核大、细胞质浓稠、细胞间无间隙，主要分布于胚及各种顶端分生组织中。分化：细胞在形态、结构和功能上发生永久性的适度变化的过程。脱分化：成熟的细胞转变为分生状态，进而分裂形成无分化的细胞团，即形成愈伤组织的过程。再分化：脱分化后的细胞再次分裂、分化并形成不同组织、进而构成器官和植株的过程再分化过程的两种方式：（1）器官发生方式：外植体-脱分化-愈伤组织-再分化-不定芽-转管-不定根-再生植株（2）无性胚胎（体细胞胚）方式：外植体-脱分化-愈伤组织-再分化-胚状体-再生植株组织培养植株再生的途径：1）、体细胞胚胎发生途径（胚状体发生途径） ： 是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构，而发育成再生植株的途径。胚状体发生途径2）、器官发生途径：由愈伤组织或外植体诱导形成不定根或不定芽，再获得再生植株的方法外植体：由活体（in vivo)植物体上切取下来的，用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞或原生质体等。愈伤组织：在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。生长素：生长素的作用是诱导愈伤组织的形成常用的有：2，4-二氯苯乙酸（2，4-D）萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA），和吲哚丁酸（IBA）作用强弱大小：（2，4-D） （NAA） （IBA） （IAA）细胞分裂素常见的有：2-异 烯腺嘌呤(2iP）,玉米素（ZT），6-苄基氨基嘌呤（BA），和激动素（KT）。它们的作用强弱：(2iP） （ZT） （BA） （KT）其他：赤霉素GA3是天然产物，能促进分化芽的生长。其他的生长调节剂：如脱落酸（ABA），乙烯利（EDDP）等在植物组织培养中也有一定作用植物组织培养的类型1.愈伤组织培养（最为常见的组织培养）2.器 官 培 养（胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养）3.细胞培养4.原生质体培养（悬浮细胞培养；单细胞培养）根据培养器官的不同：叶培养、根培养、花药培养、胚珠培养、茎尖培养等根据培养方式：固体培养、液体培养 固体培养：将培养物放在含有琼脂等固化剂的培养基表面进行培养。 液体培养：将培养物放在未加固化剂的培养基内培养，一般需进行震荡，又称液体震荡培养。固体培养、液体培养的特点：(1)固体培养法：是最常用的方法。该方法简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。(2)液体培养法：由于液体中氧气含量较少，常用振动培养的方法以确保氧气的供给往复式摇床或旋转式摇床进行培养，速度一般为50-200rmin，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。 根据培养物量的多少：大量培养、微量培养。根据培养过程中是否需光：光培养、暗培养根据培养方法的不同：平板培养、微室培养、悬浮培养等按培养过程分为:初代培养和继代培养初代培养：指外植体的最初培养。继代培养：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养， 1838-1839年，德国科学家Schleide（施耐德 ） 和Schwann（施沃恩）发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。1902年，德国植物学家Haberlandt（哈伯兰特 ） 根据细胞学说，提出植物细胞全能性（totipotency）理论。并进行了细胞培养试验，提出了激素作用理论和看护培养设想。故后人称之为“植物组培之父”1904年，Hanning（汉宁 ） 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson（克努森 ） 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。克服其种子发芽困难的问题1925年：Laibachlaib:h 亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种应用领域：快速繁殖；种苗脱毒；远缘杂交；突变育种；单倍体育种；种质保存；基因工程；植物性药物和生物制品的生产本章小结：(1)植物组织培养:是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分，在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株完整植物体的过程。(2)类型：按照外植体的不同，分为植株培养、胚胎培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型。(3)组织培养特点：培养条件可以人为控制；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于工厂化生产的突出特点，因而发展迅速。(4)组织培养技术在农业生产上的应用:主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。1、相关知识：植物生理、细胞生物、遗传、基因工程。2、相关产业：花卉、植物无土栽培、作物育种、工业化农业生产 3、技术特点： 培养条件可以人为控制；生长周期短，繁殖率高；如桉树繁殖系数3.5管理方便，利于工厂化生产和自动控制课后练习：1、名词解释：植物组织培养；细胞全能性；外植体；脱分化；再分化 2、植物组织培养种类和发展阶段。第2章 愈伤组织培养本章主要内容：愈伤组织的诱导与分化；愈伤组织的继代培养；愈伤组织的形态发生；不定芽和根的发生；体细胞胚的发生；愈伤组织培养的应用目的1、了解愈伤组织细胞分化的各时期的特点2、掌握植物激素控制理论3、掌握愈伤组织的形态发生4、区别胚状体发生途径与器官发生途径形成植株5、愈伤组织培养在园艺植物育种中的应用愈伤组织培养：定义:是指将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程愈伤组织的诱导：诱导愈伤组织的关键主要是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。愈伤组织的分化：从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：诱导期，分裂期（细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成起点），分化期。诱导期细胞内发生的变化：气体交换增加，如氧气的吸收增加;RNA含量增加（增加到300%）；蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为200%）；酶活性增强分裂期：指外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程分裂期细胞的主要表现: 1.细胞的数目迅速增加。2.每个细胞平均鲜重下降。3.细胞体积小，内无液泡。4细胞的核和核仁增大到最大。5.细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。6. 随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。分裂期愈伤组织的共同特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。分化期：指愈伤组织细胞停止分裂，细胞内发生一系列形态和生理上的变化,形成一些不同形态和功能的细胞的时期。分化期细胞特点：A 细胞分裂部位和方向发生改变：B 形成瘤状或片状的分生组织结节。或维管组织结节。C 细胞的体积相对稳定，不再减少。D 出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。E 生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色。第二节 愈伤组织的继代培养定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做继代培养培养基：1无机营养：培养基中的N，大多数都用硝态氮，对细胞分化起重要作用。2植物生长调节物质：一般使用的浓度为0.1-10mgL。使用植物生长调节剂时，要注意种类和浓度，特别是生长素和细胞分裂素的比值。 器官分化的植物激素控制理论(激素配比模式)：生长素与细胞分裂素的比值是根和芽形成的控制条件，决定着发育的方向:是愈伤组织、长根还是长芽。高-利于根的形成（生长素/细胞分裂素）；适中-利于愈伤组织的形成；低-利于芽的形成3有机成分培养基中加入糖、各类B族维生素、肌醇和甘氨酸等，可满足愈伤组织生长和分化的要求。各种氨基酸和嘌呤、嘧啶类物质，可促进器官分化。水解酪蛋白中含有多种氨基酸，助于器官分化酰胺类往往有促进器官形成的作用。培养条件：光照(光强、光照时间、光质)、温度：24-28愈伤组织的形态发生P37：形态建成：外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株愈伤组织的形态发生方式:不定芽方式；胚状体方式愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：（1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根；（2）先长芽，后长根，多数情况；（3）先长根，再从根的基部长芽。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；（4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植株。二、胚状体方式：胚状体：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。注意：体细胞胚1、不同于合子胚2、不同于孤雌/雄胚3、不同于器官发生方式形成的幼苗胚状体与合子胚的比较:合子胚胚状体质量萌发率高，质量好萌发率低，质量差来源受精卵体细胞胚柄有，明显即使有也不明显形态固定，体积相对较小复杂，常有两个以上的子叶，体积较大变异率低高胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别:胚状体具有两极性，即有茎端和根端。胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系。胚状体维管组织的分布是独立的“Y”字形。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点：胚状体产生的数量比不定芽多；胚状体可以制成人工种子，便于运输和保存；胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。愈伤组织培养的应用：1、加快了园艺植物新品种和良种繁育速度；2、培育无病毒苗木；3、获得倍性不同的植株；4、克服远缘杂交困难；5、利于种质资源长期保存和远距离运输；6、提供育种中间材料；7、诱发和离体筛选突变体；8、制造人工种子本章小结：1、愈伤组织培养含义2、愈伤组织形成分三个时期：诱导期、分裂期、分化期。3、诱导期、分裂期、分化期细胞的特点4、分裂期愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。5、继代培养的含义。6、培养方式分为固体和液体培养两大类。7、形态建成含义 。8、器官发生形成小苗的方式 。9、胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别 第三章：本章主要内容：根的培养；茎尖的培养；叶的培养本章教学目的与要求(1)一般掌握离体根培养的取材部位和培养基的选择；(2)掌握茎尖培养的种类和操作步骤；(3)掌握茎段培养中材料的选择、处理及培养基的调整；(4)掌握离体叶片的培养步骤；(5)一般掌握胚胎培养的类型与各自的注意事项。根培养（41页）的意义:1) 是进行根系生理研究的最优良实验体系;2) 是研究器官分化、形态建成的良好体系；3）可建立快速生长的根无性系。离体根的培养方法：1、培养无菌苗2、切取1.0cm的根尖3、接种在White培养基或1/2MS培养基中暗培养4、一周后，取侧根扩大培养，可得到离体根的无性系培养基：无机离子较低的White培养基或者2/3或1/2的MS、B5培养基影响离体根生长的因素：基因型，环境条件，PH，培养基，生长物质第二节 茎尖的培养1、类型 茎尖分生组织培养：对长度0.1mm左右，含1-2个叶原基的茎尖进行培养，目的是获得无病毒植株 普通茎尖培养：对几毫米至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养，目的是快速繁殖2、茎尖培养的意义：无性系快速繁殖；培养无病毒苗，品种改良；理论基础研究。二、茎尖培养的一般方法P45(一) 制备外植体取1-2cm的枝条顶梢，去小叶-消毒-解剖镜下用解剖刀除去幼叶和叶原基，露出生长点，切下0.1-0.2mm长的茎尖(含1-2个叶原基)(二)培养基：一般为MS(三)培养方法：1、固体培养法：试管培养2、纸桥培养法含义：用酒杯状的滤纸代替琼脂，使杯底朝上塞入试管中，与液体培养基接触，将离体茎尖置于滤纸上方进行培养。优点：培养基是液体培养基，营养物质能通过滤纸均衡而持久地供给外植体，有利于外植体的健康成长 ；缺点：操作工艺复杂 。四、普通茎尖培养与繁殖技术P46概念：快速繁殖(微繁殖):用组织培养的方法，使植物的部分器官、组织迅速扩大培养，并移植到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。特点：繁殖速度快；使用材料少，生产效率高，省时省工；节约空间有利于植物的工厂化生产；在无菌条件下进行，不受病虫害侵害。一茎尖微繁技术的过程：5个阶段1、无菌培养体系的建立、2、芽的增殖3、中间繁殖体的增殖4、诱导生根5、试管苗的移植初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等2、芽的增殖（1）顶芽和腋芽的发育：顶芽、侧芽生长，形成一个微型的小灌木丛状的丛生苗结构。丛生苗的每个枝条转接继代，可迅速获得多数的嫩茎。这种繁殖方式称作微型扦插或无菌短枝扦插优点：不经愈伤组织，所以最能使无性系后代保持原品种的特性（2）不定芽的发育不定芽产生的途径：外植体上直接产生，由外植体诱导的愈伤组织上产生外植体-脱分化-愈伤组织-再分化-器官原基4、壮苗和生根：壮苗目的：使增殖的嫩枝生根产生小植株，以便移栽。试管苗生根的措施：用White、1/2或1/3MS、B5等生根培养基。降低N，P，K盐的量。适当加大生长素（如NAA），不用或少用细胞分裂素，或在无激素的培养基上生根。蔗糖降低到1.0-1.5%，以增强植株自养能力；加入1%左右的活性炭；增加光强度，以提高小植株的光合能力。 (二) 影响茎尖培养微繁殖的因素：基因型，外植体的大小，供试植株的生理状态，芽在植株上的部位，供试植株的年龄，培养基，褐变，玻璃化第三节 叶的培养P53定义： 离体叶的培养是指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶等叶组织的无菌培养叶培养的意义：P531、是研究叶形态建成、光合作用、叶绿素形成的好方法2、通过叶组织的脱分化与再分化以证实叶细胞的全能性3、通过叶组织培养，探索离体叶组织培养的条件和影响因素4、建立体细胞快速无性繁殖体系5、叶细胞培养物经诱变筛选突变体。二、叶组织培养的方法P531、制备外植体：幼嫩叶片-水洗-消毒- 无菌水洗。培养基-培养2、影响培养因素：1）6-BA和KT利于芽的形成；2,4-D利于愈伤组织形成2）极性：叶片腹面向上放置利于芽的分化3）损伤：常从叶柄、叶脉的切口处形成愈伤组织和芽。三、离体叶组织中再生植株发生途径P551、直接产生不定芽2、离体叶-愈伤组织-不定芽3、离体叶-愈伤组织-胚状体-不定芽4、离体叶、茎或球状体-小鳞和离体叶、茎或球状体-愈伤组织-小鳞本章小结：(1)植物器官培养的含义。(2)离体根培养的方法、培养基、影响离体根生长的因素。(3)茎尖培养的含义；茎尖培养包括普通茎尖培养和茎尖分生组织培养。(4)纸桥培养的含义(5)茎尖微繁一般的过程 (6)离体叶组织脱分化和再分化中，茎和芽分化主的4个途径 (7)试管苗诱导生根方法。第4章 胚胎培养：是指将植物的胚胎与母体分离，培养在人工的培养基上形成幼苗的过程，包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。本章教学目的与要求(1)掌握胚培养和胚乳培养的操作步骤；(2)了解胚珠培养和子房培养的操作步骤胚胎培养的意义：克服远缘杂种的不育性，使胚胎发育不完全的植株获得后代，缩短育种年限，提高育种效率。第一节、胚培养：采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程一、培养类型：1、幼胚培养2、成熟胚培养二、培养过程：P571、幼胚培养过程：取子房；常规表面消毒；解剖镜下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚。；固体培养幼胚的发育方式： 1）胚性发育；2）早熟发育；3）产生愈伤组织2、成熟胚培养过程-以玉米成熟胚培养为例1）玉米种子消毒2）在黑暗条件下，将种子放在无菌湿润的含滤纸的培养皿中培育6hr。3）将吸涨的种子在无菌培养皿内将胚分离出来4）无菌水冲洗3次5）在MS培养基中暗培养。6）观察：2d出现胚根，3-4 d出现胚芽，10d长成幼苗。三、培养基与培养条件P582、培养条件：糖类、附加成分、光照、培养方式：幼胚培养适于液体培养，成熟胚适于固体培养 四、胚培养的应用P601)在远缘杂交育种中:克服杂种胚不能正常发育2)克服珠心胚的干扰,提高育种效率3)缩短育种周期4)测定休眠种子的萌发率5)理论研究中的应用第二节、胚乳培养P61是指将胚乳从母体上分离出来，在无菌的环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。一、胚乳培养过程P61胚乳外植体制备:种子消毒-取出胚乳培养:White或MS诱导培养基-25-27-暗或弱光发育:诱导形成愈伤组织-再分化形成胚状体或不定芽-生根培养-植株胚乳培养过程：胚乳-愈伤组织-形态发生-胚状体发育成苗或不定芽苗胚乳植株染色体数目的检查：取根尖、幼叶或愈伤组织；0.2%-0.5%秋水仙素碱溶液在25浸泡4-8hr；流水冲洗5-10min；卡诺氏液卡诺氏液的（配方:无水酒精3份:冰醋酸1份 或无水乙醇6份，氯仿3份，冰醋酸1份。）或FAA液（福尔马林（38甲醛）5ml冰乙酸5ml70酒精90 ml ）固定；1mol盐酸，60 水浴8-10min；染色、压片、镜检、计数四、胚乳培养的应用1、胚乳培养可得到三倍体植株，产生无籽果实。或加倍形成六倍体植株进行育种。2、胚乳培养可得到倍性不同的愈伤组织，可分离和筛选各种类型的非整倍体植株。三、胚乳再生植株的染色体倍数P62稳定型：三倍体畸变型：除少数是三倍体，多数是由多种倍性细胞组成的嵌合体第三节 胚珠和子房培养P63一、胚珠培养：是指将胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。胚珠培养类型：1、受精胚珠的培养2、未受精胚珠的培养（一）、胚珠培养的基本过程：P63二）、培养基：White,Nitsch,MS（三）、胚珠的发育：A 受精胚珠：一是形成种子；二是形成愈伤组织B 未受精胚珠：形成单倍体植株二、子房培养定义：子房培养是指将子房从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程类型：授粉子房的培养，未授粉子房的培养一）子房培养的培养过程1、制备外植体：在开花前后适宜时期取子房或幼花，消毒2、子房培养：固体或液体培养均可（二）培养基:N6,MS三）培养子房的发育：P63性细胞（卵细胞、助细胞、极核、反足细胞）-胚状体或愈伤组织-单倍体植株；体细胞（珠被、子房壁）-胚状体或愈伤组织-二倍体植株三、胚珠和子房培养的应用P64（一）胚珠培养的应用1、受精胚珠培养目的：一是打破种子的休眠；二是挽救胚的发育，以获得杂交种。2、未受精胚珠培养目的：获得单倍体植株（二）子房培养的应用1、授粉子房培养目的：挽救杂种胚2、未授粉子房培养目的：获得单倍体植株本章小结：(1)胚胎培养包括：幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养和胚乳培养等。(2)胚胎培养的意义。(3)离体胚培养方法：成熟胚和幼胚培养。(4)未成熟胚培养，三种不同的生长方式，胚性发育；早熟萌发；形成愈伤组织。(5)胚培养的作用。(6)检查胚珠植株的染色体数目的方法。(7)分析胚珠培养和子房培养的发育途径第5章 花药和花粉培养本章主要内容：花粉和花药培养技术，花粉和花药培养应用本章教学目的与要求(1)掌握花药培养和花粉培养的区别；(2)了解花药最佳接种时期；(3)掌握花药培养的大致过程；(4)掌握花粉发育的四种途径；(5)掌握花粉培养的大致过程。 花粉和花药的培养：是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。单倍体植物：用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。第一节 花药和花粉培养技术花药培养是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术花粉培养：是将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程一、花药和花粉的培养方法：（一）花粉发育时期：1、适宜时期：单核期,尤其是单核中、晚期(单核靠边期)。花粉粒形态：花粉粒即雄配子体。为2细胞花粉或3细胞花粉2、花粉发育时期的检测：外部形态观察：在水稻中，一般叶枕距为5-15cm，颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2时，可能为单核靠边期的花粉。压片染色法：是检测花粉发育时期的简便有效方法，常用染色剂为醋酸洋红。（二）培养过程1、花药培养过程：1）预处理:低温冷藏是最常用的方法2）表面消毒3）接种4）培养形成花粉植株。 花粉-愈伤组织-苗 ；花粉-胚状体-苗水稻花药培养过程：旗叶鞘用70酒精擦洗一遍-剥去旗叶鞘，取出稻穗- 10漂白粉10 min-无菌水洗3次-左手持穗，右手用镊子取花药，放无菌培养皿中-用接种环接种到培养基上-培养5天，花药变褐，20天后花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先长芽，后长根，形成幼苗花药采取时期：单核期：花蕾4-6mm，花药1mm花药诱导愈伤组织培养基：MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L增殖分化培养基：MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L生根培养基：1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L2、花粉培养：花粉培养成苗途径与花药培养比较: 相同点：胚状体成苗途径、愈伤组织再分化成苗途径不同点：花粉培养： 需进