2发酵液的预处理.ppt

2 发酵液的预处理 2 生物分离过程的一般流程 3 发酵液预处理的内容 固液分离 发酵液 胞外上清液 滤液 预处理 生化分离的第一步 提取生化物质的第一步 分两部分 胞内富集细胞 4 发酵液成分很复杂 包含菌 细胞 体 胞内外代谢产物 及剩余的培养基残分等 不管人们所需要的产物是胞内还是胞外 都首先要进行培养液的预处理和固液分离开 才能进行后续操作对于胞外产物 可先将菌体或其他悬浮杂质去除 才能从澄清的滤液中提取代谢产物 对于胞内产物 首先富集菌体 再进行细胞破碎和碎片分离 然后提取胞内产物 目的 促进从悬浮液中分离固形物的速度 提高固液分离的效率 改变发酵液的物理性质 包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸 降低液体黏度 相对纯化 去除发酵液中的部分杂质 高价无机离子和杂蛋白质 以利于后续各步操作 尽可能使产物转入便于后处理的一相中 多数是液相 采用絮凝或凝聚的方法 设法增大悬浮液中固体粒子的大小 提高其沉降速度 或采用稀释 加热等方法降低黏度 以利于过滤 2 1发酵液的预处理 2 1 1发酵液过滤特性的改变 微生物发酵液的特性为 发酵产物浓度较低 大多为1 10 悬浮液中大部分是水 悬浮物颗粒小 相对密度不大 固体粒子可压缩性大 液相粘度大 性质不稳定 如易受空气氧化 微生物污染 蛋白酶水解等作用的影响 微生物发酵液的成分极为复杂 其中除了所培养的微生物菌体及残存的固体培养基外 还有未被微生物完全利用的糖类 无机盐 蛋白质 以及微生物的各种代谢产物 2 1 2预处理的方法 1 加热法Heating2 调节悬浮液的PH值RegulationofPH3 助滤剂Filteraids和反应剂Reactant4 凝聚和絮凝Coagulationandflocculation5 杂蛋白的去除Removalofuselessprotein 1 加热 1 加热降低液体粘度液体黏度是温度的指数函数 升温是降低黏度的有效措施 可有效提高过滤速率 加热是发酵液预处理最简单最常用的方法 加热能改善发酵液的操作特性 麦芽汁的黏度 温度曲线 2 加热使蛋白质变性凝固变性蛋白质的溶解度小 如柠檬酸发酵液加热至80 以上 可使蛋白质变性凝固 过滤速度加快 2 调整pH 1 pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质 适当调节pH值可改善其过滤特性 2 调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法 大幅度改变pH还能使蛋白质变性凝固 3 细胞 细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒 有利于过滤的进行 0 0 200 400 600 6 12 18 pH4 6 pH4 2 pH3 8 pH2 8 FiltrateVolume cm 3 Time minutes FigTheeffectonfiltratevolumeofpH 3 凝聚与絮凝 凝聚与絮凝处理就是将某些化学药剂预先投加到悬浮液中 改变细胞 菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态 破坏其稳定性 使其聚集起来 增大体积以便固液分离 凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中 机理 1 中和粒子表面电荷 消除双电层结构2 破坏水化膜 1 凝聚指在投加的化学物质 铝 铁的化合物 作用下 使粒子相互聚集成 mm大小块状凝聚体的过程 发酵液中菌体表面带有负电荷 由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周围 在界面上形成了双电层 胶体双电层结构 蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域 阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为 Al3 Fe3 H Ca2 Mg2 K Na Li 常用的凝聚剂电解质有 硫酸铝Al2 SO4 3 18H2O 明矾 氯化铝AlCl3 6H2O 三氯化铁FeCl3 硫酸亚铁FeSO4 7H2O 石灰 ZnSO4 MgCO3 2 絮凝指使用絮凝剂 天然的和合成的大分子量聚电解质 将胶体粒子相互连接 形成10mm大小絮凝团的过程 絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物 长链状结构 其链节上含有许多活性官能团 包括带电荷的阴离子 如 COOH 或阳离子 如 NH2 基团以及不带电荷的非离子型基团 絮凝剂通过静电引力 范德华引力或氢键的作用 强烈地吸附在胶粒的表面 18 高分子絮凝剂的吸附架桥作用 絮凝剂的类型 工业上使用的絮凝剂可分为四类 人工合成有机高分子聚合物天然有机高分子聚合物无机高分子聚合物 微生物絮凝剂1 人工合成有机高分子聚合物 目前常用的是人工合成有机高分子聚合物 如聚丙烯酰胺类衍生物 聚乙烯亚胺衍生物 聚丙烯酸类和聚苯乙烯类衍生物 高分子聚合物絮凝剂根据活性基团在水中解离情况不同 可分为三类 阴离子型 含有羧基 阳离子型 含有胺基 非离子型 2 天然有机高分子絮凝剂 人工合成有机高分子絮凝剂虽然发展很快 但还存在着有毒 生物降解难等问题 所以其应用受到了限制 天然有机高分子絮凝剂具有无毒 易生物降解 原料来源广等优点 天然有机高分子絮凝剂根据其原料来源不同可分为淀粉类 纤维素类 植物胶类和聚多糖类 其中淀粉絮凝剂的研究开发最引人注目 3 无机高分子聚合物 聚合铁系和铝系两大类聚合铁絮凝剂具有操作简单 费用低 受温度影响小 亲和力强 能有效地去除悬浮物等优点 缺点腐蚀性强 稳定性差 聚合铝系是目前应用广 工艺较成熟的一类无机金属盐絮凝剂 絮凝效果好 缺点具毒性等 4 微生物絮凝剂 微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂 由微生物或其分泌物产生的具有絮凝功能的代谢产物 包括直接利用微生物细胞的絮凝剂 利用微生物细胞壁代谢产物的絮凝剂 克隆技术所获得的絮凝剂主要成分是糖蛋白 多糖 纤维素及核酸等高分子物质 微生物絮凝剂和天然絮凝剂 与化学合成的絮凝剂相比 最大的优点是安全 无毒和不污染环境 常用微生物絮凝剂 红平红球菌 浮游藻类 分枝杆菌 硅酸盐芽孢杆菌 絮凝的影响因素 发酵液的性质 细胞浓度 表面电荷 絮凝剂的浓度 絮凝效果呈钟形变化 pH控制 pH主要影响离子型絮凝剂功能团的电离度 从而影响了分子链的伸展状态 改变了絮凝作用搅拌速度 4 加入助滤剂 filteraids 一种不可压缩的多孔微粒 在发酵液中加入助滤剂 菌体可吸附在助滤剂上 降低了过滤阻力 目前生物工业中常用的助滤剂是活性炭 石英砂 石棉粉 纤维素 硅藻土 珍珠岩粉等 加入某些不影响目标产物的反应剂 可消除发酵液中的一些杂质对过滤的影响 从而提高过滤速度 1 加入反应剂与某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀 生成的沉淀能防止菌丝体粘结 使菌丝具有块状结构 又能使蛋白质凝固 过滤性能上升 沉淀本身可作为助滤剂 如在新生霉素发酵液中加入CaCl2和Na3PO4 生成Ca3 PO4 2沉淀 2 发酵液中含有不溶性多糖物质时 用酶将其转化为单糖 以提高过滤速率 如万古霉素用淀粉作培养基 发酵液过滤前加入0 025 的淀粉酶 搅拌30min后 再加2 5 硅藻土助滤剂 可提高过滤效率5倍 5 加入反应剂 发酵液中的杂质 高价无机离子 Ca2 Mg2 Fe2 杂蛋白 在采用离子交换提炼时 会影响树脂对生化物质的交换容量 在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力 在常规过滤或膜过滤时 易使过滤介质堵塞或受污染 影响过滤效率 因此 在预处理时 应尽量除去这些物质 2 1 3发酵液的相对纯化除去发酵液中一些杂蛋白或高价无机离子 1 高价无机离子的去除方法 1 Ca2 草酸 草酸钠 形成草酸钙沉淀 注意回收草酸 2 Mg2 三聚磷酸钠 形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物 3 Fe2 黄血盐K4 Fe CN 6 普鲁士兰沉淀法K Fe2 CN 6Fe3 2 杂蛋白去除1 沉淀法precipitation2 变性denaturation3 吸附法adsorption 1 沉淀法precipitation A 等电点沉淀法 isoelectricprecipitation 蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中 在酸性溶液中带正电荷 在碱性溶液中带负电荷 在某一pH下 净电荷为零 溶解度最小 称为等电点 蛋白质的等电点大都在酸性范围内 pH4 0 5 5 调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法 B 酸碱调节 使蛋白质与离子形成沉淀在酸性溶液中 蛋白质与一些阴离子形成沉淀 如三氯乙酸盐 水杨酸盐 苦味酸盐等 在碱性溶液中 蛋白质与一些阳离子形成沉淀 如Cu2 Zn2 Fe3 Ag 等 2 变性Denaturation 蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性 变性蛋白质溶解度较小 加热 大幅度调节pH值 加酒精 丙酮等有机溶剂或表面活性剂等 不足之处 加热法只适合于对热较稳定的目的产物 极端pH值也会导致某些目的产物失活 且要消耗大量酸碱 有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合 链霉素生产中 采用调pH至酸性 pH3 0 加热至70 维持半个小时的方法来使蛋白变性 能使过滤速度增大10 100倍 滤液粘度可降低1 6 柠檬酸发酵液 采用加热至80 以上 使蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度 从而大大提高了过滤速度 蛋白质变性例子 3 吸附法adsorption 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去 四环类抗生素生产中 采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成胶状沉淀来吸附蛋白质 利用此法除蛋白质已取得很好的效 在枯草杆菌发酵液中 常加入氯化钙和磷酸氢二钠 这两者本身生成庞大的凝胶 把蛋白质 菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去 从而加快了过滤速度 2 2菌体的回收 2 2 1影响发酵液菌体回收的因素 1 发酵液中悬浮粒子的大小形状 2 发酵液的黏度viscosity 固液分离速度通常与粘度成反比 粘度越大 菌体回收越困难 影响粘度的因素 菌体的种类和浓度 重要因素 通常丝状菌 动物或植物细胞悬浮液粘度较大 浓度增大 粘度也提高 培养液中蛋白质 核酸大量存在 通常细胞破碎或粘度增大 因此细胞破碎的程度应控制 时间要适宜 培养基成分 如用黄豆粉 花生粉作氮源 淀粉作碳源 粘度都会升高 此外 某些染菌发酵液 如染细菌 则粘度会增大 发酵过程的不正常处理 如大量过剩的培养基和消沫油加入 都会使粘度增大 2 2 2常见的菌体回收方法 膜分离membraneseparation离心Centrifugation 第5章 过滤filtration 39 膜分离技术 概念 用半透膜作为选择障碍层 利用膜的选择性 孔径大小 以膜的两侧存在的能量差作为推动力 允许某些组分透过而保留混合物中其它组分 从而达到分离目的的技术 40 常见膜分离方法 按分离粒子大小分类 透析 Dialysis DS 微滤 Microfiltration MF 超滤 Ultrafiltration UF 纳滤 Nanofiltration NF 反渗透 Reverseosmosis RO 电渗析 Electrodialysis ED 渗透气化 Pervaporation PV 41 截留分子量 微滤0 02 10 m透析3000Dalton 几万Dalton超滤50 10 或5000 50万Dalton纳滤200 1000Dalton或1nm反渗透200Dalton 42 um A RELATIVE SIZEOF COMMON MATERIAL过滤对象 MOLECULAR WEIGHT分子量 0 001 10 0 01 100 0 1 1000 1 0 10 4 10 10 5 100 1000 10 6 10 7 100 200 5 000 20 000 150 000 500 000 Aqueoussalts中水盐份 Metalions金属离子 Sugars蔗糖 FILTRATION TECHNO LOGY过滤方法 Pyrogens热源 Virus病毒 Colloidalsilica胶体硅 Albuminprotein白蛋白 Bacteria细菌 Carbonblack碳黑 Paintpigment颜料色素 Yeastcells酵母 Milledflour面粉 Beachsand海滩沙砾 Pollens花粉 RO反渗透 Ultrafiltration超滤 Microfiltration微滤 Particlefiltration一般过滤 THEFILTRATIONSPECTRUM过滤谱图 NF纳滤 2 2 3过滤filtration 定义 过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程 过滤系统 过滤介质filtermedium 过滤采用的多孔物质 滤浆filterpulp 所处理的悬浮液 滤液filtrate 通过多孔通道的液体 滤饼或滤渣filtercake 被截留的固体物质 1 实验室用抽滤装置 1 常用过滤设备 实验室用抽滤机板框压缩机鼓式真空过滤机离心分离机硅藻土过滤机 2 板框压滤机 板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的液压 广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌 放线菌 酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离 适合于固体含量1 10 的悬浮液的分离 板框式压滤机在过滤时 悬浮液由离心泵进入框内 滤液穿过滤框两侧滤布 从滤液