泡腾片中的Vc含量测定.doc

高压液相色谱法测定维生素C泡腾片中维生素C的含量 摘要 目的 文章建立了高压液相色谱测定维生素C泡腾片中维生素C含量的方法，以检测所选用的Vc泡腾片产品中的Vc含量是否符合标示规格。 方法 采用0.02%的草酸溶液为溶剂；色谱中采用C18色谱柱，以0.02%的草酸溶液为流动相；流速1ml/min，检测波长为254nm，进样量20ul。结果 维生素C在0.1mg/ml0.9mg/ml的范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，平均回收率为102.4%。结论 应用该方法测定维生素C的含量具有简便、快速、可靠的有点，可重复性好；经测定，所选用的力度伸维生素C泡腾片每片所含维生素C约0.95g，与厂家标示的1g/片基本相符。关键字 维生素C泡腾片；高压液相色谱；维生素C1 前言 高压液相色谱（HPLC）系统由输液泵，进样器，色谱柱，检测器，数据处理和计算机控制系统以及恒温装置组成。由于使用的色谱柱填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，所以称高压液相色谱。溶于流动相中的各组分经过固定相时，与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，在色谱图上出峰时间有先后，保留时间不同。本实验使用反相色谱法，采用C18柱，根据样品中各组分在固定相与流动相中分配系数的不同样品中各物质得到分离，在流出曲线上表现不同的峰及保留时间。维生素C泡腾片作为一种保健品，具有崩解迅速、起效快、口服吸收良好、生物利用率高等优点，兼具固体制剂和液体制剂的特长且携带和使用方便。它可用于增强机体抵抗力, 预防和治疗各种急、慢性疾病、坏血病或其他疾病, 常用于病后恢复期、创伤愈合期及过敏性疾病的辅助治疗。本次试验选择了力度伸维生素C泡腾片，希望通过高压液相色谱法来检测每片泡腾片维生素C的实际含量，以确定是否与厂家标示的Vc含量相符。2 仪器与试药高压液相色谱仪，紫外检测器，电子天平，研钵，烧杯，玻璃棒；0.02%草酸溶液（0.2g草酸粉末溶于1L去离子水,抽滤后超声脱气30min），维生素C标准对照品，甲醇（超声脱气30min），去离子水3 方法与结果3.1 色谱条件色谱柱C18柱；流动相：0.02%的草酸溶液；流速：1ml/min；检测波长：254nm；柱温为室温；进样量：20ul。3.2 线性关系考察精密称取维生素C标准品0.5mg，1.5mg，2.5mg，3.5mg，4.5mg分别加5ml流动相溶液即0.02%草酸溶液配制成浓度分别为100ug/ml，300ug/ml，500ug/mll，700ug/ml，900ug/ml的标准品溶液，用0.45um滤膜过滤。在上述色谱条件下准确进样20ul。以标准品溶液浓度对峰面积作图，其线性回归方程为y=32238x，R2=0.9972，线性范围为0.10.9mg/ml。 图1 维生素C标准品色谱图（棕色色谱峰：900ug/ml标准品溶液，深蓝色：700ug/ml，绿色：500ug/ml,淡蓝色：300ug/ml,紫色：100ug/ml）图2 维生素C的标准工作曲线3.3 精密度实验精密吸取900ug/ml的标准品溶液20ul，连续进样3次，结果峰面积分别为29230578、29812116、29463544(见图3)，平均峰面积为29502079.33，RSD为0.9%。HPLC系统设备稳定性、精确性良好。图3 精密度试验色谱图合成图（红、黄、蓝色色谱峰分别为第一、第二、第三次进样结果）3.4 稳定性实验在标准品溶液（900ug/ml的标准品溶液）第一次进样后4小时再次进20ul。第一次进样测得900ug/ml的标准品溶液色谱峰面积为9155820，4小时后测得结果为8868664。结果显示，4个小时后维生素C样品溶液有3%的损失。图4 稳定性试验流出曲线对照图（红色色谱峰由该标准品溶液第一次检测产生，蓝色色谱峰由同一样品4小时候后再次进样产生）3.5 重复性试验取维生素C泡腾片样品两片，于干净研钵中研碎。精密称取4.6mg三份，分别加5ml流动相溶液配置成供试品溶液1,2,3，使用0.46um滤膜过滤，分别进样20ul。测得供试品溶液1,2,3的色谱峰面积分别为6147210,6428546,6238013，RSD为0.22%（图5）。图5 重复试验样品色谱图合成图3.6 加样回收试验称取样品4.6mg与适量维生素C标准品混合溶解成5ml，使得配置好的溶液的维生素C浓度分别比待测样品溶液的维生素C浓度大100ug/ml与大200ug/ml（分别编号a、b），均进样20ul。测定回收率，结果如表一所示，得到本实验的平均回收率为102.4%。表1 回收率试验数据表3.7 样品含量测定 取维生素C泡腾片样品两片，于干净研钵中研碎，精密称取4.6mg，用0.02%的草酸溶液溶解，使用0.46um滤膜过滤,进样20ul。结果中色谱峰面积为6271256，结合2.2得到的线性回归方程计算得供试样品的Vc浓度为194.53mg/ml。由于样品回收率为102.4%，所以一片维生素C泡腾片（约为4.6g/片）含维生素C 0.95g 。4 讨论4.1 使用标准品溶液进行初始尝试的色谱条件流动相为0.02%草酸溶液：甲醇=95:5；流速1ml/min;检测波长：254nm;进样量：20ul。得到的色谱图（图一）有三个部分交叠的峰，会对峰面积的积分产生影响，造成实验结果的不准确。出现杂峰的原因可能为使用的维生素C标准品保存时间过长，已有部分Vc氧化分解。当使用新鲜的Vc标准品后，杂峰消失。也可能是第一次标准品称量等处理过程中带入了污染。图一4.2为了降低杂峰对目标峰峰面积积分的影响，实验中首先尝试更改流动相洗脱力,降低流速。通过降低甲醇的比例使各物质的保留时间发生不同程度的改变使杂峰与目标峰分离。色谱条件为甲醇：草酸=0.02：0.78, 流速为0.8ml/min，检测波长254nm。此时色谱图如图二所示，在目标峰后的一个杂峰消失。 图二随后，将波长改为267nm,希望在此检测波长下，杂质的吸收减小、Vc的吸收加大从而使剩下的杂峰对目标峰峰面积积分的影响降低。从该条件下得到的色谱图表明（图二），在267nm波长下杂质与Vc的吸收均降低，尤其是Vc吸收降低剧烈。故此方案不可行。图三继续降低甲醇含量，即在甲醇：草酸=0：0.8,0.8ml/min，254nm,的色谱条件下得到图四。之前在色谱图中消失的第三个峰现在出现在了Vc的吸收峰之前（见图四）。图四产生上述现象的原因是流动相甲醇比例降低造成流动相洗脱力降低，各物质保留时间推迟，但产生第三个峰的物质对甲醇浓度的改变较不敏感，保留时间延长较其他两个物质少，于是相对的，出峰时间前移。图一中第三个峰在图二中消失可能就是在图二的条件下，第三个峰前移并入较大的第二个峰，使其不在色谱图中被区分。4.3 从精密度试验、重复性试验结果看，本实验的误差受机器和操作影响较小。稳定性显示，四小时内标准品溶液中的Vc有3%的损失。维生素 C 分子中的烯二醇基具有极强的还原性，其水溶液在空气中极不稳定，易被氧化为二酮基而成为去氢抗坏血酸。本实验使用0.02%的草酸溶液保护Vc不被氧化。由于样品配置到测定进样的时间远小于4小时，故Vc损失对结果的影响不大。回收率实验得到的回收率大于100%可能是计算过程中线性回归曲线的使用带来了偏差，不影响实验结果的可信性。4.4本实验同样可以用碘量法、2, 4-二硝基苯肼法、荧光光度法等完成。碘量法测定时可能会在判断终点时产生人为的误差，使滴定结果误差较大。后两种方法 试样前处理比较复杂。虽然高压液相色谱法由于各种样品基体不同、干扰因素不同而使检测条件相对不够完善，但由于其具有高压、高速、高效的特点，必然会得到广泛应用。参考文献1 薛继雄, and 刘金来. 反相高效液相色谱法测定复方维生素泡腾片中维生素 C 的含量.医药导报1.7 (2007): 62 陈再洁, 郑建明, 王智. 高效液相色谱法测定维生素 C 片中 Vc 含量.分析仪器6 (2008): 37-39.3 徐岳鑫, 董赛文, and 张雪峰. 高效液相色谱法测定维 C 银翘片中维生素 C 含量.中国药业17.10 (2008): 40-40.4 王蕊, et al. 高效液相色谱法测定维生素 C 片的含量.黑龙江医药23.006 (2010): 876-87